Функции σ-субъединиц РНК-полимераз Escherichia coli и Thermus aquaticus на разных стадиях транскрипции

• Автор: Жилина, Екатерина Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 124 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
а, а-субъединица - сигма-субъединица РНКП а70 - а70-субъединица аА - ал-субъединица
К coli, Есо - Escherichia coli Т. aquaticus, Taq - Thermns aquaticus T. thermophilus, Tth - Thermus thermophilus
ht - нуклеотид, нуклеотиды
пн - пара нуклеотидов
NTP (НТФ) - рибонуклеотидтрифосфат
dNTP - дезоксирибонуклеотидфосфат
РНКП - РНК-полимераза, РНК-полимеразы
ПААТ - полиакриламидный гель

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Цели и задачи исследования
Научная новизна и практическая значимость работы
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1 I РНКП бактерий строение и функции
1 1 1 РНКП и общие сведения о транскрипции
112 Транскрипционный цикл
1 2 Структура и функции кор-фермента РНКП
1 3 Структура о-субъединицы
14 Взаимодействие о-субъединицы с кор-ферментом
1 5 Роль о-субъединицы в инициации транскрипции
1 5 1 Разнообразие функций о-субъединицы в процессе транскрипции
1 5 2 Узнавание промоторных элементов в ДНК о-субъединицей
15 3 Формирование открытого промоторного комплекса
1 5 4 Плавление промоторной ДНК
1 5 5 Формирование напряженного комплекса в процессе инициации
15 6 Диссоциация о-субъединицы при переходе от инициации к элонгации
1 6 Структура и функции элонгационного комплекса бактериальной РНКП
1 7 Паузы транскрипции
1 7 1 Разновидности транскрипционных пауз и их функции
17 2 Промотор-проксимальная о-зависимая пауза транскрипции
1 7 3 Обратное смещение РНКП при формировании о-зависимой паузы
1 7 4 Gre-факторы и их роль на разных этапах транскрипции
1 7 5 Формирование напряженных элонгационных комплексов при образовании о-зависимой паузы
1 8 Заключение
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2 1 Белки, плазмиды, олигонуклеотиды
2 2 Приготовление растворов
22 1 Буферные растворы
2 2 2 Краски для нанесения на ПААГ
2 3 Основные методы работы с ДНК и РНК
2 3 1 Электрофорез в полиакриламидном геле
2 3 2 Осаждение ДНК
2 3 3 Очистка ДНК-олигонуклеотидов в геле
2 4 Получение радиоактивно меченых олигонуклеотидов и промоторных фрагментов
2 4 1 Получение меченых ДНК- и РНК-олигонуклеотидов
2 4 2 Получение промоторного фрагмента /acUV5
2 5 Футпринтинг перманганатом калия
2 6 Транскрипция in vitro в искусственных элонгационных комплексах
2 6 1 Сборка искусственных элонгационных комплексов
2 6 2 Иммобилизация элонгационных комплексов на твердой фазе
2 6 3 Исследование кинетики образования паузы
2 6 4 Получение элонгационных комплексов с разной длиной РНК
2 6 5 Расщепление РНК в присутствие GreB
2 7 Экзонуклеазный футпринтинг
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3 1 Роль различных участков а-субъединиц РНКП Е coli и Т aquaticus в плавлении промоторной ДНК
3 1 1 Различия в температуре плавления промоторов РНКП разных бактерий
3 1 2 Исследование роли районов а-субъединиц РНКП Е coli и Т aquaticus в плавлении промотора
3 1 3 Исследование роли неконсервативных аминокислотных остатков в районе 2 а-субъединицы в
плавлении промоторной ДНК
3 14 Возможные функции неконсервативных аминокислотных остатков района 2 а-субъединиц Е coli и
Т aquaticus в плавлении промоторов
3 2 Изучение механизма a-зависимой паузы транскрипции
3 2 1 Участие а-субъединицы в элонгации транскрипции
3 2 2 Сборка искусственного элонгационного комплекса m vitro
3 2 3 Влияние последовательности ДНК на формирование a-зависимой паузы
3 2 4 Влияние концентрации нуклеотидов на формирование паузы

3.2.5. Влияние концентрации о70-субъединицы на образование паузы
3.2.6. ст-независимая пауза транскрипции на участке паузы
3.2.7. Обратное смещение РНКП при формировании а™-зависимой паузы
3.2.7.1. Расщепление РНК в смещенных назад элонгационных комплексах
3.2.7.2. Последовательность в участке паузы, стимулирующая обратное смещение РНКП
3.2.7.3. Подавление формирования паузы антисмысловыми ДНК-олигонулеотидами
3.2.8. Образование напряженных элонгационных комплексов при формировании а-зависимой паузы
3.2.9. Влияние мутаций в кор-ферменте РНКП E. coli на формирование а-зависимой паузы
3.2.9. Сравнение а-зависимых пауз, формируемых РНКП E. coli и Т. aquaticus
3.2.10. Исследование роли различных районов а-субъединицы в формировании а-зависимой паузы
3.2.11. Исследование влияния замен неконсервативных аминокислотных остатков в районе 2 а-субъединицы на формирование паузы
3.2.12. Общий механизм формирования а-зависимой паузы транскрипции
4. ВЫВОДЫ
Список публикаций по теме диссертации
Благодарности
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

взаимодействие района 2.2 а-субъединицы с районом «двойная спираль» Р’-субъединицы может сохраняться после ухода РНКП с промотора и является достаточным для того, чтобы а оставалась связанной с кор-ферментом в составе элонгационного комплекса (Young et al., 2001) или связалась заново с элонгационным комплексом (Mooney et al., 2005).
Инициация и уход РНКП с промотора являются этапами, определяющими общую скорость транскрипции. Ступенчатый переход от инициации транскрипции к элонгации и, в особенности, абортивный синтез РНК являются обратной стороной способности РНКП к старту полимеризации РНК в отсутствие затравки (праймера).
1.6. Структура и функции элонгационного комплекса бактериальной РНКП
В процессе элонгации транскрипции РНКП осуществляет процессивный и точный синтез РНК на матрице ДНК. В ходе синтеза РНК могут формироваться паузы транскрипции, происходить процессы аттенюации, антитерминации транскрипции; элонгация завершается терминацией. Данные о пространственной структуре элонгационного комплекса бактериальной РНКП были получены с использованием РНКП термофильных бактерий Т. aquaticus и Т. thermophilus (Рис. 1.13) (Vassylyev et al., 2007-b; Vassylyev et al., 2007-с), а также РНКП II S. cerevisiae (Gnatt et al., 2001; Kettenberger et al., 2004; Wang et al., 2006). Важнейшие контакты РНКП с ДНК и РНК в бактериальных и дрожжевых элонгационных комплексах очень сходны между собой.
При формировании элонгационного комплекса благодаря подвижности доменов “clamp” («зажим»), pi- и р2-субъединиц кор-фермента происходят конформационные изменения РНКП, которые приводят к плотному обхватыванию нуклеиновых кислот (ДНК, РНК и ДНК-РНК гибрида) внутри РНКП (Vassylyev et al., 2002; Zhang et al., 1999). Передний дуплекс ДНК в элонгационном комплексе помещается внутри главного канала между доменами “clamp” («зажим») и “jaw” («челюсть») Р’-субъединицы и доменом Р2 р-субъединицы.
В активном центре фермента, где происходит присоединение нуклеотидов, соответствующих матрице ДНК, находится 3’-конец синтезируемой РНК. В канале выхода РНК располагается 5’-конец транскрипта, который контактирует с “flap’’-доменом Р-субъединицы («заслонкой»). Нуклеотиды, по всей видимости, попадают в активный центр через вторичный канал, так как со стороны главного канала доступ нуклеотидам полностью перекрыт нуклеиновыми кислотами (РНК, ДНК и РНК-ДНК гибрид) (Korzheva