Молекулярный анализ микробных сообществ мест залегания углеводородов на дне озера Байкал

• Автор: Кадников, Виталий Валерьевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 122 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Углеводороды: характеристика, биологическое и геохимическое образование
2. Микроорганизмы, осуществляющие анаэробную деградацию углеводородов
3. Методы исследования биоразнообразия микроорганизмов
4. Микробные сообщества мест залегания газовых гидратов в морских осадках
5. Разнообразие микроорганизмов озера Байкал
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Микробное сообщество микроорганизмов, ассоциированных с газовыми ^ гидратами на дне озера Байкал
2. Микробное сообщество микроорганизмов битумных холмов в естественных ^ выходах нефти на дне озера Байкал
ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Изучение биоразнообразия микроорганизмов и структур микробных сообществ занимает центральное место среди задач экологии микроорганизмов и имеет важное значение как для понимания биогеохимических циклов, так и для пополнения знаний о ресурсах биосферы. Уникальной экологической нишей является озеро Байкал, возраст которого оценивается в 20-30 млн. лет. Его характеризуют большие глубины, низкая температура воды и постоянство химического состава вод в глубинной части. Высокая насыщенность кислородом всей толщи воды, низкая концентрация органических веществ и минерализация воды обуславливают специфические условия жизнедеятельности организмов. Около 60% флоры и фауны Байкала являются эндемиками (Тимошкин, 2001).
В последние годы на дне Байкала открыты места приповерхностного залегания газовых гидратов и выходов нефти, но признаков загрязнения вод Байкала нефтью не выявлено. Вероятно, в этих районах происходят активные процессы биодеградации, а возможно и образования углеводородов, ключевую роль в которых играют микроорганизмы донных осадков и водной толщи.
В настоящее время углеводороды являются одним из основных источников энергии. Превращение комплексов органического вещества в метан - важнейший биологический процесс в глобальном цикле углерода. Метан может выходить в атмосферу в газовой форме, или быть изолированным в твердой форме, в виде газовых гидратов. Около 500-2500 гигатонн суммарного углерода в виде газовых гидратов метана находится в глубоководных морских осадках (Milkov, 2004) и большая часть этого метана имеет биологическое происхождение (Kvenvolden, 1995). Недавние исследования показали, что разнообразные микробные сообщества ассоциированы с метановыми гидратами морских осадков, которые были отобраны в районах впадины Нанхай (Reed et al., 2002; Newberry et al., 2004), в Охотском море (Inagaki et al., 2003), в Перу и Cascadia Margins в восточной части Тихого океана (Bidle et ah, 1999; Marchesi et ah, 2001; Yoshioka et ah, 2010). Микробные процессы могут способствовать не только образованию метановых гидратов, но также и их разрушению через анаэробное окисление метана (АОМ), осуществляющееся некоторыми линиями архей.
Исследования микробных сообществ нефтяных резервуаров показали, что обитающие в них микроорганизмы влияют на качество и выход нефти (Head et ah, 2003, 2006). Было показано, что действие микроорганизмов может повышать эффективность нефтеотдачи (Lake, 1989), но также и оказывать негативные эффекты, такие как биодеградация углеводородов и коррозия нефтепроводов (Magot et al., 2000; Nemati et al.,
2001; Head et al., 2003; Li and Hendry 2008). В тоже время нефть и нефтепродукты являются одним из основных загрязнителей окружающей среды. Микроорганизмы обладают огромным разнообразием ферментных систем и путей метаболизма, с использованием которых они способны разлагать широкий спектр химически устойчивых соединений, возвращая основные химические элементы в глобальные циклы. Изучение биодеградирующих способностей микроорганизмов стало наиболее актуально в последние десятилетия, когда в биосфере значительно увеличилось количество устойчивых загрязнителей антропогенного происхождения. Результаты исследования микроорганизмов, участвующих в процессах биодеградации нефти и ее производных представлены в многочисленных публикациях (Leahy and Colwell, 1990; Барышникова и др., 2001; Head et al., 2006). Впервые бактерии, разлагающие углеводороды, были выделены около ста лет назад (Sohngen, 1913). Наиболее охарактеризованы процессы деградации углеводородов в аэробных условиях, но известны и анаэробные процессы, использующие другие окислители. В настоящее время способность использовать углеводороды в качестве единственного источника углерода и энергии отмечена, по крайней мере, у 80 родов бактерий, у 9 родов цианобактерий, у 103 родов грибов и 14 родов водорослей (Head et al., 2006). Несмотря на большое количество публикаций о биодеградации углеводородов, наши знания об этих процессах, в особенности о механизмах биодеградации углеводородов в анаэробных условиях, крайне ограничены (Head et al., 2006). Исследование микробных сообществ экологических ниш, ассоциированных с естественными выходами углеводородов, в которых осуществляются процессы их биодеградации, расширят наши знания об этих процессах.
Ранее в рамках микробиологических исследований донных отложений Байкала проводили определение численности микроорганизмов и сезонной динамики, изучение различных физиологических групп (Луста и Намсараев, 1988; Лаптева, 1990). В исследованиях использовали методы электронной микроскопии, биохимии и радиоизотопного анализа (Земская и др., 1997). Однако, известно, что как правило не более 0.1-1% микроорганизмов из природного сообщества удается культивировать в лабораторных условиях, поэтому при исследовании природных образцов классическими методами большая часть сообщества остается неизученной (Amann et al., 1995).
Для характеристик состава микробных сообществ используются как традиционные микробиологические методы, предполагающие получение чистых культур микроорганизмов и их характеристику, так и молекулярные методы идентификации микроорганизмов по последовательностям генов 16S рРНК, не требующие культивирования. Идентификация микроорганизмов осуществляется в результате
последовательностей. Практически сочетание кластеризации на уровне 97% и фильтрация по качеству с параметром 0.2% ошибки на нуклеотид (соответствует phred quality score 27) позволяет получить число филотипов, соответствующее ожидаемому.
Поскольку большая часть ошибок пиросеквенирования связана с определением числа одинаковых нуклеотидов в гомополимерных участках, экспериментально определенные последовательности фрагментов 16S рРНК, отличающиеся только этим показателем, вероятно, относятся к одному филотипу. Программа Pyronoise (Quince et al., 2009) и ее усовершенствованная версия, AmpliconNoise (Quince et al., 2011) позволяет идентифицировать такие последовательности и объединять их в один филотип. Применение этого метода позволяет проводить более точную количественную оценку величины биоразнообразия (Quince et al., 2009).
Однако, помимо ошибок в прочтении гомополимерных участков, на долю которых приходится 60-80% всех ошибок, в чтениях могут обнаруживаться инсерции и точечные замены (Табл. 6, Behnke et al., 2011), которые не «учитываются» Pyronoise /AmpliconNoise. Для их устранения в работе (Behnke et al., 2011) предложено прмимо применения обычных фильтров качества исключать из анализа последовательности, присутствующие в исходном наборе данных в единственном числе (синглтоны) и, с высокой вероятностью, являющиеся следствием таких ошибок. Конечно, такое исключение может привести к потере реально существующих филотипов, однако, проведенная в работе (Behnke et al., 2011) оценка показывает, что лишь 0.25% всех синглтонов представляли реально существующие филотипы.
Таблица 6. Источник ошибок при пиросеквенировании генов малых субъединиц рРНК с использованием технологий FLX и Titanium (Behnke et al., 2011).
V4-GS-FLX V4-GS-FLX Titanium V9-GS-FLX V9-GS-FLX Titanium
No. % of total errors No. % of total errors No. % of total errors No. % of total errors
2-Homopolymers 237 6.3 2 133 9.3 719 18.0 401 18.
3-Homopolymers 143 3.8 3 151 13.7 1080 27.0 563 26.
4-Homopolymers 620 16.6 5 471 23.8 988 24.7 730 34.
5-Homopolymers 777 20.8 6 460 28.1 - - -
6-Homopolymers 609 16.3 1 312 5.7 - - _ -
Insertions 1160 31.0 6 0.0 1019 25.5 301 14.
Transitions 57 1.5 665 2.9 135 3.4 79 3.
Transversions 141 3.8 3 803 16.5 59 1.5 48 2.
Sum 3744 23 001 4000 2
Таким образом, оптимальным способом учета ошибок пиросеквенирования может быть применение программы АтрПсопНо'^с, удаляющей чтения низкого качества и учитывающей ошибки прочтения гомополимерных участков, с последующим исключением из анализа всех оставшихся синглтонов.