Получение иммунореагентов и разработка экспрессных иммунохимических методов для определения ксенобиотиков

• Автор: Яковлева, Юлия Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 172 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 1. Методы иммунохимического анализа низкомолекулярных соединений
1Л. Дизайн гаптенов для иммунизации и анализа
1.2. Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ
1.3. Твердофазный иммуноферментный анализ в проточной системе
1.3.1. Регенерация и стабильность иммобилизованных реагентов
1.3.2. Анализ в проточной системе с хемилюминисцентной детекцией
1.4. Миниатюризация иммуноанализа
ГЛАВА 2. Иммобилизация иммунореагентов на кремниевых носителях
2.1. Иммобилизация низкомолекулярных гаптенов
2.2. Методы ковалентной иммобилизации антител
2.2.1. Иммобилизация на функционально активированных носителях
2.2.2. Модификация кремниевых носителей гидрофильными полимерами
2.2.3. Ориентированная и аффинная иммобилизация антител
2.3. Иммобилизация ЫС-связьшающих белков
ГЛАВА 3. Экологическое воздействие и методы анализа ксенобиотиков
3.1. Неионные ПАВ: алкилфенолполиэтоксилаты и их метаболиты алкилфенолы
3.2. Анионные ПАВ: линейные алкилбензолсульфонаты
3.3. Гербициды семейства хлорацетанилидов
3.4. Гербициды семейства сульфофенилмочевины
3.5. Г ербициды семейства 1,3,5-сим-триазинов
ГЛАВА 4. Материалы и методы
4.1. Материалы и оборудование
4.2. Методы исследования

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 5. Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ ПАВ
5.1. Стратегия получения антител и разработки ПФИА нонилфенола
5.1.1. Получение и характеристика антител и флуоресцентных трейсеров
5.1.2. Влияние структуры реагентов на стадию конкуренции и специфичность метода
5.2. Влияние структуры реагентов на ПФИА линейных алкилбензолсульфонатов
ГЛАВА 6. Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ гербицидов
6.1. Разработка специфичного ПФИА хлорацетанилидных гербицидов
6.1.1. Получение и характеристика антител
6.1.2. Изучение аналитических характеристик и специфичности метода
6.2. ПФИА гербицидов семейства сульфонилмочевины в водных объектах
6.2.1. Дизайн реагентов и изучение аналитических характеристик метода
6.2.2. Исследование специфичности метода и анализ водных образцов
ГЛАВА 7. Разработка иммуночипов с иммобилизованными антителами
7.1. Дизайн микропроточной системы с хемилюминесцентной детекцией
7.2. Иммобилизация антител на модифицированных кремниевых микрочипах
7.3. Оптимизация буферной системы и изучение неспецифического связывания
7.4. Регенерация и краткосрочная операционная стабильность
7.5. Долгосрочная стабильность при хранении и использовании
7.6. Аналитические характеристики иммуночипов
ГЛАВА 8. Иммуночипы с иммобилизованными IgG-связывающими белками
8.1. Метод иммобилизации IgG-связываюгцих белков
8.2. Регенерация иммуночипов
8.3. Оптимизация условий анализа и долгосрочная стабильность
8.4. Аналитические характеристики иммуночипов
8.5. Анализ образцов поверхностных вод и фруктового сока
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АМД - аминодекстран;
АПТЭС - 3-аминопропилтриэтоксисилан;
АФ - алкилфенолы;
4-АФ - 4-аминофенол;
АФПЭ - алкилфенолполиэтоксилаты;
ББ - боратный буфер;
БСА - бычий сывороточный альбумин;
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;
ГА - глутаровый альдегид;
Г АФ - глициламинофлуоресцеин;
ГОПС - З-глицидоксипропилтриметоксисилан;
ГХ - газовая хроматография;
ЖХ - жидкостная хроматография;
ЖЭ - жидкостная экстракция;
ИФА - иммуноферментный анализ;
ИХМ - иммунохимические методы;
КМД - карбоксиметилдекстран;
КЭ - капиллярный электрофорез;
ЛАС - линейные алкилбензолсульфонаты;
ЛПЭИ - линейный полиэтиленимин;
МПК - 3-меркаптопропионовая кислота;
МПТС - 3-меркапрорпропилтриметоксисилан;
МС - масс-спектрометрия;
НФ - 4-нонилфенол;
ОВА - овальбумин;
ОФ -4- октилфенол;
ПАВ - поверхностно-активные вещества;
ПВС - поливиниловый спирт;
ПДК - предельно допустимая концентрация вредного вещества; ПО - предел обнаружения;
ПР - перекрестное реагирование;
ПФИА - поляризационный флуоресцентный иммуноанализ;
ПЭГ, имеющего молекулярную массу 400 Да для иммобилизации антител против овальбумина (ОВА) БСА, и Esherichia coli удалось значительно повысить антиген-связывающую активность по сравнению с АПТЭС-модифицией носителя [132]. В другой работе сообщается, что при использовании ПЭГ (MW 3,400 Да) для иммобилизации моноклональных антител против флуоресцеина наблюдались стерические затруднения при связывании антигена в результате плотной упаковки молекул IgG [120]. Поверхностная плотность иммобилизованных антител в этом случае составила 2.1х10-12 моль/см2, что почти в два раза превышает плотность монослоя (l.lxlO-12 моль/см2). В результате антиген-связывающая активность иммобилизованных IgG по сравнению с нативными антителами в растворе снизилась до 13.6%.
Декстран является еще одним гидрофильной полимером, используемым для модификации кремниевых носителей и снижения неспецифического связывания. Декстран представляет собой разветвленный полимер, состоящий из остатков a-D-глюкопиранозы, соединенных (1-»6) связями [133].
Для ковалентной иммобилизации декстрана на поверхности носителя наиболее часто применяется метод окисления перйодатом натрия и последующая реакция с аминогруппами носителя с образованием оснований Шиффа [127,134]. В результате реакции окисляется от 20 [135] до 50% [127] гидроксильных групп. Меньшую степень модификации декстрана можно получить в результате его активации трезилхлоридом [136] или 4-нитрофенилхлорформиатом [137], которые активируют от 8 до 20% гидроксильных групп. Схема реакций активации и иммобилизации декстрана на носителе с активными аминогруппами приведена на Рис. 7 (а, б). Последующая иммобилизация антител в слое декстрана проводится через s-аминогруппы остатков лизина.
Реакция декстрана с хлоруксусной кислотой с образованием карбоксиметилдекстрана (КМД) представляет еще один способ активации гидроксильных групп. При сравнении свойств иммобилизованных IgG на кремниевом носителе, модифицированном КМД и АПТЭС, было показано, что КМД значительно увеличивает поверхностную концентрацию активных антител [124]. При использовании КМД количество активных иммобилизованных IgG составляет 212x10"15 моль/мм2, что в 9 раз превышает плотность монослоя.