Исследование методом конфокальной микроскопии динамики светозависимой продукции H2O2 в протопластах фотосинтезирующих клеток высших растений

• Автор: Найдов, Илья Александрович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 88 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
ВВЕДЕНИЕ
Цель и задачи работы
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Строение протопластов и клеток листа
1.2. Кислород и активные формы кислорода
1.3. Процессы образования активных форм кислорода
в фотосинтетической электрон-транспортной цепи
1.4. Процессы утилизации активных форм кислорода. Антиоксидантные системы растительных клеток
1.5. Антиоксидантные системы тилакоидной мембраны
1.6. Образование активных форм кислорода в митохондриях
1.7. Защитная роль водно-водного цикла в хлоропластах
1.8. Сигнальная роль активных форм кислорода
1.9. Флуоресцентная и конфокальная микроскопия 29
1.10. Детекторы АФК
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Выделение протопластов
2.2. Выделение изолированных интактных хлоропластов шпината
2.3. Окрашивание протопластов H2DCF-DA
2.4. Окрашивание Hoechst33258
2.5. Окрашивание MitoTracker RED
2.6. Окрашивание суспензии изолированных хлоропластов AmplexRed_41 2.7 Оценка жизнеспособности протопластов с помощью метода
РАМ-флуориметрии
2.8. Конфокальная микроскопия

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Особенности наблюдения фотосинтезирующих объектов
3.2. Исследование объектов разной степени интактности
3.3. Флуоресценция DCF в протопластах в процессе освещения
3.4. Кинетика флуоресценции DCF в хлоропластах при освещении
3.5. Крахмальные зерна в хлоропластах
3.6. Изменение соотношения флуоресценции DCF в цитоплазме
и хлоропластах
3.7. Выход Н202 из хлоропластов
3.8. Скорость фиксации С02 не влияет на накопление Н2Ол
3.9. Влияние концентрации аскорбата на скорость накопления Н202
в хлоропластах
3.10. Эффект остановки циклозиса
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
Аск - аскорбат;
АФК - активные формы кислорода;
ВВЦ - водно-водный цикл;
ВОК — водоокисляющий комплекс;
Кат - каталаза;
Пх — пластохинон;
СОД - супероксиддисмутаза;
ССК1 и ССК2 — светособирающий комплекс фотосистемы 1 и 2; Фд - ферредоксин;
ФС1 и ФС2 - фотосистемы 1 и 2;
ФЭТЦ - фотосинтетическая электрон-транспортная цепь;
BSA — бычий сыворотчный альбумин;
DCF — дихлорофлуоресцеин;
DCMU - 3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметилмочевина (диурон); FDA — флуоресцеин диацетат;
H2DCF-DA - дигидродихлорофлуоресцеин диацетат.

более удобны в этом отношении, так как флуоресценция в зеленой области спектра лежит далеко от границы спектра флуоресценции хлорофилла и не поглощается хлорофиллом. Однако молекулы флуорофоров, находящиеся внутри хлоропластов оказываются в значительной степени экранированы от света, возбуждающего их флуоресценцию, большим количеством молекул хлорофилла, расположенного в тилакоидных мембранах. Таким образом, чувствительность H2DCF к Н202 внутри хлоропластов субъективно ниже чем в цитоплазме и неокрашенных органеллах.
В настоящее время разработано несколько модифицированных форм флуоресцеина, которые могут в течение длительного времени удерживаться внутри живых клеток после окрашивания и обладающие более высокой избирательностью к Н202: CM-H2DCF-DA, carboxy-H,DCF-DA, aminophenyl-fluorescein (APF) и hydroxyphenyl-fluorescein (HPF).
Fla основе флуоресцентного красителя, резоруфина разработаны детекторы Н202 - Amplex Red (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine)
и Amplex UltraRed. Аналогично другим детекторам, эти красители реагируют с FI202 с участием пероксидазы и образуют исходное флуоресцирующее соединение - резоруфин, обладающего флуоресценцией в ближней, красной области. Amplex UltraRed отличается более высокой стабильностью и меньшей зависимостью квантового выхода флуоресценции от pH при рН>5.0. Оба этих детектора широко используются как для регистрации Н202 так и для определения количества и активности глюкозооксидазы и пероксидазы в иммунофлуоресцентном анализе (Zhou et al, 1997).
На базе флуоресцентных красителей MitoTracker Red и MitoTracker Orange также существуют восстановленные формы, используемые в качестве детекторов АФК: MitoTracker Orange CM-H2TMRos и MitoTracker Red CM-H2XRos. Так же как и H2DCF-DA после реакции с АФК, они восстанавливают свою способность флуоресцировать, однако, за счет своего заряда, локализуются преимущественно в митохондриях.