TAR-клонирование короткого плеча хромосомы 7 человека в YAC и анализ функционально-значимых последовательностей

• Автор: Глазкова, Дина Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 145 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
Глава 1 ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Искусственные хромосомы дрожжей
2.1.1 Клонирование методом лигирования in vitro
2.1.2 Клонирование методом трансформационно-ассоциированной рекомбинации
2.2 Терминальные участки хромосом
2.2.1 Теломеры
2.2.2 Теломерные повторы
2.2.3 Белки, связывающиеся с теломерами
2.2.4 Структура теломеры
2.2.5 Теломераза
2.2.6 Теломераза и изменение длины теломер
2.2.7 Субтеломерная область
2.2.8 Прителомерная область
2.2.9 Клонирование терминальных последовательностей хромосом человека
2.3 Эндогенные ретровирусы человека
2.3.1 Введение
2.3.2 Ретроэлементы генома человека
2.3.3 Эндогенные ретровирусы
2.3.4 Роль эндогенных ретровирусов в геноме человека
2.3.5 Регуляция промоторной активности LTR HERV в конструкциях с репортерным геном
2.3.6 Ретровирусы семейства HERV-K
2.3.7 Заключение
ГлаваЗ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 Объекты, использованные в работе
3.1.1 Штаммы дрожжей и бактерий
3.1.2 Гибридные линии
3.1.3 Образцы первых цепей ДНК для RT-PCR анализа
3.1.4 Плазмиды
3.2 Среды
3.3 Основные методики
3.3.1 Процедуры молекулярного клонирования
3.3.2 Выделение ДНК из дрожжей
3.3.3 Выделение высокомолекулярной ДНК из гибридных клеток
3.3.4 Трансформация бактериальных клеток
3.3.5 Трансформация дрожжевых клеток
3.3.6 Определение митотической стабильности
3.3.7 Пульс-электрофорез ДНК
3.3.8 Блоттинг по Саузерн
3.3.9 Гибридизация ДНК на фильтрах

3.3.10 Гибридизация дрожжевых колоний in situ
3.3.11 ПЦР анализ
3.3.12 RT-PCR анализ
3.3.13 Определение активности лихеназы
3.3.14 Гибридизация in situ ДНК YAC с метафазными хромосомами человека с флуоресцентной детекцией сигнала (FISH)
ГЛАВА4 РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1 Создание YAC-клонотеки короткого плеча хромосомы 7 человека
4.1.1 Клетки соматического гибрида RuRag 14-4-7-44 - источник 7р ДНК
4.1.2 Подбор условий трансформации
4.1.3 Получение линейных YAC
4.1.4 Получение кольцевых YAC
4.1.5 Отбор YAC клонов с ДНК человека
4.1.6 Характеристика клонотеки
4.2 Поиск субтеломерных и теломерных фрагментов
4.2.1 Обоснование
4.2.2 Праймеры, использованные для скрининга, их расположение на 7р
4.2.3 Анализ “одноплечих” YAC
4.2.4 Структурная стабильность “одноплечих” YAC
4.2.5 YAC
4.3 Последовательности LTR HERV-Kхромосомы 7р человека
4.3.1 Скрининг библиотеки методом блот-гибридизации
4.3.2 Поиск последовательностей LTR HERV-K методом полимеразной цепной реакции
4.3.3 Картирование FISH
4.3.4 Определение нуклеотидных последовательностей LTR и прилегающих к ним участков
4.3.5 Сравнение последовательностей LTR с международной базой данных GenBank
4.3.6 Транскрипция LTR-содержащих локусов хромосомы 7р человека в клетках нормальной паренхимы яичка и в клетках семиномы
4.3.7 Исследование промоторной активности LTR HERV-K в клетках дрожжей
ГЛАВА5 ОБСУЖДЕНИЕ
5.1 Создание YAC-клонотеки
5.2 Терминальная последовательность хромосомы 7р
5.3 Последовательности LTR HERV-Kхромосомы 7р
5.3.1 Анализ LTR-содержащих локусов
5.3.2 Возможная роль LTR в регуляции транскрипции исследованных локусов
5.3.3 Промоторная активность LTR в дрожжах
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений:
ADE2 - ген, кодирующий фосфорибозиламино-имидазол-карбоксилазу ARS - автономно реплицирующаяся последовательность CEN - центромера
HERV (Hunan Endogenous Retrovirus) - эндогенный ретровирус человека
LINE (Long Interspersed Nuclear sequence) - длинный диспергированный повтор
LTR (Long Terminal Repeat) - длинный концевой повтор
MMTV (Mouse Mammary Tumor Virus) - вирус рака молочной железы мышей
OD (ОП) - оптическая плотность
ORF - открытая рамка считывания
RT (Reverse Transcriptase) - обратная транскриптаза
RT-PCR - полимеразная цепная реакция с использованием в качестве матрицы продуктов обратной транскрипции
SINE (Short Interspersed Nuclear sequence) - короткий диспергированный повтор ТЕ - мобильный элемент TEL - теломера
TRP1 - . дрожжевой ген, кодирующий Н-(5’-фосфорибозил)-антранилат изомеразу
URA3 - дрожжевой ген, кодирующий оротидин-5’-фосфат декарбоксидазу
YAC (Yeast Artificial Chromosome) - дрожжевая искусственная хромосома
YPD - богатая дрожжевая среда
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
КТ - комнатная температура
млн.пн - миллион пар нуклеотидов
мРНК - матричная РНК
пн - пар нуклеотидов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РНК - рибонуклеиновая кислота
тпн - тысяч пар нуклеотидов

значительное количество представителей различных семейств эндогенных ретровирусов (Larsson et at., 1989; Cohen and Larsson, 1988; Wilkinson et at., 1994; Sverdlov, 1998). Среди них представлены как
однокопийные, так и многокопийные эндогенные ретровирусы (O'Connel et а/., 1984; Repaske et at., 1985; Leib-Mosch et at., 1990; Ono et at., 1986; La Mantia et at., 1991). Отличительной особенностью эндогенных ретровирусов является их большое разнообразие. В то время как в геноме человека содержится относительно немного различных семейств коротких (SINE) и длинных (LINE) диспергированных повторов, количество различных семейств эндогенных ретровирусов составляет несколько десятков. Помимо полноразмерных провирусов, в геноме имеется большое количество связанных с ними последовательностей: одиночные длинные концевые повторы
соответствующих ретровирусов (La Mantia et at., 1991; Leib-Mosch et at., 1993), ретротранспозоны, включающие в себя фрагменты ретровирусного генома (Ono et г'., 1987). Практически всегда эндогенные ретровирусы являются дефектными, поскольку содержат многочисленные мутации в кодирующих областях.
Систематика эндогенных ретровирусов человека весьма запутана и неупорядочена. Один из возможных подходов - классификация на основе вида тРНК, которая является праймером для инициации обратной транскрипции. В соответствии с этим признаком HERV классифицируют как HERV-E (инициатор — тРНК глутаминовой кислоты), HERV-H (гистидиновая тРНК), HERV-K (лизиновая тРНК) и т.д. Поскольку несколько кодонов могут кодировать одну и ту же аминокислоту, и используется несколько разных тРНК, то в ряде случаев в наименовании используют последовательность соответствующего антикодона (например, HERV-K(CUU)). Но и этому подходу свойственны недостатки — совершенно не связанные друг с другом ретровирусы могут использовать одну и ту же тРНК для инициации обратной транскрипции. Другим подходом для классификации эндогенных ретровирусов является сравнение их с гомологичными современными экзогенными ретровирусами.
Для семейств ретровирусов HERV-H и LTR HERV-H, а также для HERV-К и соответствующих им LTR предложено разделение на подсемейства (Goodchild et at., 1993; Anderssen et at., 1997; Medstrand et at., 1997; Khil et at., 1997;