Получение трансгенных растений табака, экспрессирующих гены глюканаз термофильных бактерий, в качестве моделей для изучения роли полиглюкангидролаз в растениях

• Автор: Ализаде Хушанг
• Шифр специальности: 03.00.15, 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 147 с.

Список сокращений
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Молекулярные механизмы устойчивости растений на атаку фитопатогенами
1.1.1 Локально индуцированные защитные ответы растений
1.1.2. Системная приобретенная резистетность (SAR)
1.1.3. Патоген-родственные белки растений (PR-белки)
1.1.4. Индуцированная системная устойчивость и другие защитные
пути у растений
1.1.5. Существует ли общий путь активации разных защитных ответов?
1.2. Бета-глюканазы растений
1.2.1. ß-ГЗ-глюканазы
1.2.2. ß-1,3-1,4-глюканазы
1.2.3. Элиситоры защитных ответов растений
1.3. Бактерии родов Thermotoga и Clostridium, их
глюканогидролазные комплексы, доменная структура их глюкангидролаз
1.3.1. Структурные особенности ß-13-глюканазы (ламинариназы)
Thermotoga neapolitana
1.3.2. Структурные особенности ß-1,3-1,4-глюканазы (лихеназы)
Clostridium thermocellum
1.3.3. Использование глюкангидролаз термофильных бактерий в прикладных и фундаментальных исследованиях 43 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Модификация бактериальных ферментов и сравнительное изучение биохимических свойств делеционных вариантов и полноразмерных белков ß-глюканаз
3.1.1. Модификация и свойства делеционного варианта и полноразмерного фермента р-1,3-глкжаназы
3.1.2. Модификация и свойства делеционного варианта и полноразмерного фермента Р-1,3-1,4-глюканазы
3.2. Конструирование трансгенных растений табака, экспрессирующих бактериальные гены Р-глюканаз
3.2.1. Конструирование экспрессионных векторов для трансформации растений, несущих бактериальные гены Р-1,3-глюканазы
и Р-1,3-1,4-глюканазы
3.2.2. Трансформация растений табака и получение первичных трансформантов
3.3. Молекулярно-биологический анализ первичных трансформантов растений табака, экспрессирующих бактериальные гены р-глюканаз
3.3.1. Способность листовых дисков первичных трансформантов к каллусообразованию на среде с канамицином
3.3.2. Анализ геномной растительной ДНК на наличие в ее составе последовательностей бактериальных генов р-глюканаз методом гибридизации по Саузерну
3.3.3. Количественные уровни активности бактериальных р-глюканаз у трансгенных растений различных линий
3.3.4. Эффективная секреция бактериальных р-глюканаз
в межклеточное пространство трансгенных растений посредством лидерного пептида экстенсина моркови
3.3.5. Метод зимограмм и метод чашечного теста для качественного анализа активности бактериальных Р-глюканаз
3.4. Морфологический, физиолого-биохимический и молекулярно-биологический анализ трансгенных растений табака, экспрессирующих бактериальные гены р-глюканаз
3.4.1. Морфологические характеристики трансгенных растений, экспрессирующие бактериальные гены Р-глюканаз
3.4.2. Физиолого-биохимические характеристики
трансгенных растений, экспрессирующие бактериальные гены р-глюканаз
3.4.2.1. Морфогенетический потенциал листовых эксплантов трансгенных растений различных линий
3.4.2.2. Фотосинтетические пигменты трансгенных растений табака, экспрессирующих бактериальные р-глюканазы
3.4.2.3. Спектры основных и кислых полипептидов, экстрагированных из листьев трансгенных растений табака, экспрессирующих бактериальные р-глюканазы
3.4.2.4. Антигрибная активность экстрактов различных линий трансгенных растений
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

аффинной хроматографии использовали Ni-NTA (QIAGEN, GmbH, Германия) и протокол фирмы-изготовителя.
2.6. Методы определения активности В-глюканаз термофильных бактерий
2.6.1. Спектрофотометрический метод (метод определения
восстанавливающих сахаров и глюкозы)
Активность (3-глюканаз измеряли по модифицированному нами методу Miller et al. (1960). Активность ферментов измеряли при 80°С в 50 мМ фосфатном буфере pH 6.2 для р-1,3-глюканазы и при 65°С в 50мМ трис-HCl буфере pH 8,0 для (3-1,3-1,4-глюканазы, используя в качестве субстратов ламинарии и лихенан. Реакционная смесь состояла из 200 мкл субстрата и 100 мкл бактериального или растительного белкового экстракта. Через 10 и 20 минут после начала инкубации при оптимальной для каждого фермента температуре добавляли 1,2 мл динитросалицилового реагента и смесь прогревали при 100°С в течение 15 минут. После охлаждения измеряли оптическую плотность раствора при 510 нм (Ultraspec II, LKB). Концентрацию восстанавливающих сахаров (как эквивалент глюкозы) определяли по калибровочному графику, построенному с помощью растворов глюкозы 50-400 мкг/мл. Все растворы для калибровочного графика готовили из набора реактивов Sigma Diagnostics Kit (Cat. No. 510), пользуясь руководством фирмы.
За единицу активности (1 Ед.) принимали количество фермента, образующее 1 мкмоль восстанавливающих сахаров за 1 мин. Удельную активность рассчитывали делением активности препарата фермента на его количество белка.
Для приготовления динитросалицилового реагента в 300 мл Н20 последовательно растворяли 300 мг 3,5-динитросалициловой кислоты, 130 г натрия лимоннокислого пятиводного, 2 г Na2S205 и 5 г КОН. Раствор прогревали при 50°С с перемешиванием, доводили pH раствора до 13.6-13.7 с помощью КОН, с последующим фильтрованием раствора. Реагент хранили в темном месте при +Ю°С.