Структурно-функциональные взаимосвязи полипептидов Кунитц-типа актинии Heteractis crispa

• Автор: Табакмахер, Валентин Михайлович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 140 с. : ил.

Благодарности
Прежде всего, я хотел бы поблагодарить моих научных руководителей и учителей, к.ф,-м.н. Елену Александровну Зелепуга и д.х.н. Маргариту Михайловну Монастыриую, за руководство, поддержку на всех этапах выполнения настоящей работы и помощь в оформлении данного исследования в виде диссертации. Они помогли мне понять логику проведения научного эксперимента, научиться писать научные статьи и понять основы научной этики. Особенно я благодарен за создание рабочей атмосферы исследовательского азарта, а также за научные дискуссии, которые легли в основу нашего исследования, и ценные советы, которые помогли мне развить собственные идеи и стать независимым ученым.
Я благодарю заведующего лабораторией химии пептидов ТИБОХ им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, д.х.н. Эмму Павловну Козловскую, за созданные условия и уникальные возможности для работы, а также ценные замечания и рекомендации при выполнении данного исследования. Я искренне признателен за оказанную помощь в выполнении отдельных этапов исследования моим коллегам в лаборатории химии пептидов, к.х.н. Ирине Николаевне Гладких и к.х.н. Елене Владимировне Лейченко, а также аспирантам Оксане Владимировне Синцовой, Римме Сергеевне Калиной, Александре Николаевне Кветкиной и студентке Анастасии Андреевне Терентьевой. Я глубоко признателен к.х.н. Виктории Евгеньевне Чаусовой и к.б.н. Екатерине Сергеевне Ткачёвой за помощь и обучение экспериментальным методам белковой химии на начальных этапах выполнения данной работы. За сотрудничество и помощь в проведении биоиспытаний я благодарю сотрудника группы изучения биологически активных добавок, к.б.н. Ольгу Николаевну Кривошапко.
Я благодарен за помощь, методологические дискуссии и практические советы аспирантам и студентам лаборатории морской биохимии, Надие Муссаевне Тищенко, Евгении Петровне Быстрицкой!, Василию Александровичу Голотину, Николаю Владимировичу Гончарову, Надежде Юрьевне Чернышевой, а также сотрудникам лаборатории химии ферментов к.х.н. Артёму Сергеевичу Сильченко, лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета к.х.н. Ольге Вениаминовне Сидоровой и лаборатории инструментальных и радиоизотопных методов анализа к.х.н. Станиславу Дмитриевичу Анастюку.
Я глубоко признателен за сотрудничество и помощь всем сотрудникам и аспирантам лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов ИБХ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, а также заведующему, д.х.н., академику РАН Евгению Васильевичу Гришину, за предоставленную возможность провести часть экспериментальной работы в данной лаборатории. Отдельно мне бы хотелось поблагодарить к.б.н. Ярослава Алексеевича Андреева и к.х.н. Дмитрия Игоревича Осмакова за обучение основам молекулярного клонирования и работы с рекомбинантными биополимерами.
Я искренне благодарен заведующему лабораторией межмолекулярных взаимодействий ИБМХ им. В. II. Ореховича, д.б.н. Алексею Сергеевичу Иванову, а также к.б.н. Оксане Валентиновне Гнеденко за сотрудничество при проведении биосенсорных исследований и помощь в интерпретации полученных результатов.
Я благодарю сотрудников лаборатории биотехнологии БПИ ДВО РАН, к.б.н. Константина Вадимовича Киселёва и к.б.н. Алексея Петровича Тюнина, за плодотворные научные дискуссии, профессиональные консультации, ценные советы и рекомендации при выполнении экспериментальной части работы.

За поддержку на разных этапах выполнения работы'я хочу поблагодарить сотрудников ТИБОХ им. Г.Б. Елякова ДВО РАН: Андрея Владимировича Есипова, к.х.н. Сергея Анатольевича Дышлового, д.б.н., член-корр. РАН Валерия Викторовича Михайлова, к.х.н. Викторию Васильевну Сова, к.б.н. Константина Анатольевича Дроздова, д.х.н. Ольгу Данииловну Новикову, д.х.н. Вячеслава Леонидовича Новикова, к.х.н. Дмитрия Константиновича Чистюлина; сотрудников ИБХ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН: д.х.н., член-корр. РАН Виктора Ионовича Цетлина, д.ф-м.н. Романа Гербертовича Ефремова, к.ф.-м.н. Антона Олеговича Чугунова, к.ф.-м.н. Павла Евгеньевича Волынского, к.х.н. Дмитрия Евгеньевича Нольде, к.ф.-м.н. Антона Александровича Полянского, к.ф.-м.н. Константина Сергеевича Минеева. За моральную поддержку я благодарю моих друзей: Константина Анатольевича Якимчука, Евгению Сергеевну Константинову, Алексея Анатольевича Косарева, Дмитрия Анатольевича Якимчука, Сергея Александровича Дегтярёва, Алексея Алексеевича Патрикеева, Элину Александровну Радченко, Ивана Андреевича Денисова, Вячеслава Леонидовича Макогина, к.х.н. Наталью Викторовну Агеенко, Алексея Владимировича Костеша, Вадима Валерьевича Искучекова, Максима Григорьевича Капранова, Марию Сергеевну Перловскую, к.б.н. Ольгу Владимировну Апаликову, Лидию Ивановну Титову и Олега Петровича Каминского.
Отдельно я благодарю к.б.н. Ирину Альбертовну Бронову и к.б.н. Евгения Витальевича Бердышева за то, что они убедили меня поступить в аспирантуру и заняться научно-исследовательской деятельностью. За лояльность и поощрение моего интереса к этому занятию я благодарю моего отца, Михаила Иосифовича Табакмахера, мою мать, Татьяну Владимировну Табакмахер, и сестру, Ксению Михайловну Табакмахер.
Настоящая работа выполнена во многом благодаря поддержке, проявленному вниманию и интересу каждого из этих людей.

Список используемых сокращений и обозначений
1. Введение
2. Литературный обзор
2.1. Яды животных как источник биологически активных соединений
2.2. Компонентный состав ядов животных: молекулярное разнообразие и механизмы формирования
2.3. Структурное и функциональное разнообразие биологически активных полипептидов ядов животных. Комбинаторные библиотеки
2.3.1. Полипептиды со структурным мотивом цистеинового узла
2.3.2. Трехпетлевые токсины змей
2.3.3. Полипептиды с цистеин-стабилизированным а/(3-мотивом
2.3.4. Перспективы использования полипептидов ядов животных
2.4. Полипептиды Кунитц-типа
2.4.1. Структура
2.4.2. Взаимодействие с сериновыми протеиназами
2.4.3. Структурные особенности и функциональное разнообразие
2.4.3.1. Доменные и мультидоменные ингибиторы Кунитц-типа
2.4.3.2. Полипептиды Кунитц-типа яда змей
2.4.3.3. Полипептиды Кунитц-типа яда пауков
2.4.3.4. Полипептиды Кунитц-типа яда скорпионов
2.4.3.5. Полипептиды Кунитц-типа яда конусов
2.4.3.6. Полипептиды Кунитц-типа земноводных
2.4.3.7. Полипептиды Кунитц-типа яда перепончатокрылых
2.4.3.8. Полипептиды Кунитц-типа яда актиний
2.5. Молекулярные мишени полипептидов Кунитц-типа актиний
2.5.1. Сериновые протеиназы
2.5.1.1. Классификация
2.5.1.2. Механизм катализа гидролитического расщепления пептидной связи
2.5.1.3. Функциональное разнообразие
2.5.2. Ионные каналы - молекулярные мишени полипептидов Кунитц-типа
2.5.2.1. Общая характеристика ионных каналов
2.5.2.2. Потенциалзависимые ионные каналы. К%. каналы
2.5.2.3. Рецептор Т11РУ1
2.5.2.4. Структура и функциональные детерминанты ТЯРУ!

полипептиды, значения молекулярных масс которых лежат в диапазоне 5800 - 7500 Да (рис. 28, Б, В, Г), что характерно для типичных ингибиторов Кунитц-типа из актиний [80, 119-131, 133, 134].
Aî14t
[CH3CN],%
Л 1000-

О 500-
« Я
6500
) mfz
Рисунок 28. - ОФ ВЭЖХ белковых компонентов фракции (рис. 27, пик 5). А - Профиль элюции на колонке с "Nucleosil Cig (4,6x250 мм), уравновешенным 10% ацетонитрилом в 0,1 % ТФУ, pH 2,2, в градиенте концентрации ацетонитрила от 10 до 60% в 0,1 % ТФУ (pH 2,2) за 60 мин. Скорость элюции — 0,5 мл/мин. Пунктиром показаны границы фракций, проявивших трипсинингибируклцую активность. Серым цветом показаны границы объединения фракций, использованных для дальнейшего выделения полипептидов. Б, В, Г - Масс-спектры полипептидов, содержащихся в белковых фракциях (пики 1, 2 и 3 соответственно).
Белковые компоненты фракций, соответствующих пику 2 (рис. 28, А),
рехроматографировали на колонке с Nucleosil Сы (рис. 29, А). По данным масс-спектрометрического анализа полипептидов объединенных фракций пика 1 (рис. 29, А) их молекулярные массы соответствовали 6106 и 6332 Да. Повторная рехромотография позволила получить в гомогенном состоянии полипептид, проявляющий трипсинингибирующую активность, с молекулярной массой 6106 Да (рис. 29, Б). Следует отметить, что она соответствует массе ингибитора Кунитц-типа InhVJ, выделенного из Н. crispa ранее [127, 128]. Полученные фракции были объединены и лиофилыю высушены для дальнейших исследований. Масса лиофильного препарата ингибитора трипсина составила 5 мг.