Исследование резонансного переноса энергии биолюминесценции в гибридных белках и их комплексах

• Автор: Гороховатский, Андрей Юрьевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 133 с. : ил.

Список сокращений
I. ВВЕДЕНИЕ
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: РЕЗОНАНСНЫЙ ПЕРЕНОС ЭНЕРГИИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ
II. 1. Резонансный перенос энергии флуоресценции
II. 1.1. Основные понятия и термины
II. 1.2. Ограничения FRET
11.2. Методы детектирования резонансного переноса энергии
11.2.1. Равновесная спектроскопия
11.2.2. Измерения времени жизни возбужденного состояния
Н.2.2Л. Импульсный метод
П.2.2.2. Фазово-модуляционный метод
И.2.3. FRET-микроскопия
II.2.4. Измерения на уровне одиночных донор-акцепторных пар
11.3. Синтетические хромофоры, используемые в приложениях резонансного переноса энергии
И.3.1. Органические флуоресцентные метки
И.3.2. Люминесцентные хелаты лантаноидов
И.З.З. Полупроводниковые нанокристаллы
11.4. Зеленый флуоресцентный белок - генетически-кодируемый флуорофор в приложениях FRET
11.4.1. Спектральные свойства GFP
11.4.2. Варианты зеленого флуоресцентного белка
11.4.3. GFP-подобные флуоресцентные белки из других организмов
И.4.4. Использование FRET между вариантами GFP
И.4.4.1. Внутримолекулярные FRET-индикаторы
II.4.4.2. Межмолекулярные FRET-индикаторы
11.5. Резонансный перенос энергии биолюминесценции

11.5.1. Люциферазы Renilla reniformis и Aequorea victoria
11.5.2. Механизм переноса энергии
11.5.3. Использование BRET
III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
III. 1. Материалы и реактивы
111.2. Генетические конструкции
111.3. Экспрессия генетических конструкций в клетках E. coli и очистка рекомбинантных белков
111.3.1. Акворин, обелин и гибриды GFP/EGFP-Aeq/Ob
111.3.2. GFPhEGFP
111.3.3. Гибрид EGFP-RLuc
111.3.4. Гибрид BCCP-EGFP
111.3.5. Гибрид SAV-Aeq
111.3.6. Активация апо-белков целентеразином
111.3.7. Определение концентрации белков
111.4. Спектральные методы
111.4.1. Спектры поглощения и кругового дихроизма
111.4.2. Спектры флуоресценции
111.4.3. Спектры биолюминесценции
111.4.4. Биолюминесцентная активность Са2+-активируемых фотобелков и их гибридов
111.4.5. Расчет интеграла спектрального перекрывания и Ro
111.4.6. Определение эффективности BRET
111.4.6.1. Анализ спектров
111.4.6.2. Измерение сигнала BRET в двулучевом люминометре
111.4.7. Кинетические измерения методом остановленного потока
111.5. Электрофоретические методы
111.5.1. ДСН-ПААГ электрофорез
111.5.2. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану
111.6. Иммунологические методы

111.6.1. Выделение IgG кролика
111.6.2. Получение поликлональных антител к GFP
111.6.3. Получение поликлональных антител к акворину
111.6.4. Обработка нитроцеллюлозных мембран
HI.7. Другие методы
111.7.1. Трипсинолиз гибридного белка GFP-19-Aeq
111.7.2. Определение активности каспазы-3 in vitro
111.7.3. Калибровка сигнала BRET
111.7.4. Определение Kcat/KM
111.7.5. Определение активности каспазы-3 в клеточных лизатах
111.7.6. Биотинилирование EGFP и IgG кролика
111.7.7. Анализ биотина
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
IV.1. Экспрессия генетических конструкций и очистка гибридных белков.

IV.2. Спектральные характеристики гибридных белков и эффективность
внутримолекулярного BRET
IV.3. Исследование механизмов внутримолекулярного BRET в акворинсодержащих гибридных белках
IV.4. Характеристика биолюминесцентных субстратов для определения
активности каспазы-3 методом внутримолекулярного BRET
IV.5. Тестирование белок-белковых взаимодействий методом межмолекулярного BRET
V. ВЫВОДЫ
VI. БЛАГОДАРНОСТИ
VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

в единой рамке считывания с 5’-концевой последовательностью, кодирующей HisTag/Trombin/STag.
EGFP, Плазмида pEGFP-N3 (CLONTECH) была использована в качестве источника гена EGFP. Продукт ПЦР с этой плазмиды с использованием праймеров 5 ’-TGGCTAGCAAGGGCGAGGAG-3 ’ и 5’-
GCGGATCCTTTACTTGTACAGCTCGTC-3 ’ (участки рестрикции Nhel и BamHI подчеркнуты) был клонирован в рЕТИС. Полученная конструкция pET/EGFP содержала полную последовательность кДНК EGFP и была предназначена для экспрессии в клетках E.coli под контролем Т7 промотора.
Гибриды GFP/EGFP-обелин/акворин. Кодирующая последовательность обелина была амплифицирована с использованием праймеров 5'-ttggtaccggtTCTTCAAAATACGCA-З' и 5'-ttgtcgacTTAGGGAACTCCGTTGC-3' (участки рестрикции Kpnl и Sali подчеркнуты) и плазмиды pNOV в качестве матрицы [223]. Амплифицированный фрагмент был обработан рестриктазами Kpnl и Sali и клонирован в плазмиду pETl lcjoe с образованием конструкции рЕТ/ОЬ.
Аналогично, кодирующая последовательность акворина была амплифицирована с использованием праймеров 5'-ttggtaccggtAAGCTTACATCA-GACTTC-3' и 5'-ttgtcgacTTAGGGGACAGCTCCA-3 ’ и плазмиды mtAEQ/pMT2 в качестве матрицы [310] и клонирована в плазмиду pETl lcjoe с образованием конструкции pET/Aeq.
Кодирующая последовательность GFP (вариант «cycle 3» с заменами Q80R/F100S/M154T/V164А для улучшения сворачивания белка) была амплифицирована с плазмиды pBAD-GFPuv [115] с использованием праймеров 5'-ATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTC-3' и 5'-ttggtacccggTTTGTAG-AGCTCAT-3' (участки рестрикции Nhel и Kpnl подчеркнуты). Амплифицированный фрагмент был клонирован по участкам NheHKpnl в конструкции рЕТ/ОЬ и pET/Aeq с образованием, соответственно, pET/GFP-4-Ob и pET/GFP-4-Aeq. Полученные плазмиды, pET/GFP-4-Aq и pET/GFP-4-Ob, со-ответсвенно, кодировали гибридные белки GFP-4-Aq и GFP-4-Ob, содержа-