Разработка эффективных систем экспонирования белков на поверхности клеточной стенки дрожжей Yarrowia lipolytica для создания продуцента клеточно-связанной липазы

• Автор: Юзбашева, Евгения Юрьевна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 102 с. : ил.

Список сокращений:
CWP (cell wall grotein) - белок клеточной стенки GPI — гликозилфосфатидилинозитол
PIR-CWPs (grotein internal repeats CWPs) - белки клеточной стенки, в N-концевой части которых расположены повторы аминокислотного мотива, обусловливающие высокое О-гликозилирование и ковалентное связывание белка с (3-1,3-гликана.ми клеточной стенки
ед - единица активности липазы. 1 ед соответствует высвобождению
мкмоль пара-нитрофенола за 1 мин при 24°С в 1 мл рабочего раствора
ВКПМ - Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов
АТСС - Американская Коллекция Типовых Культур
CLIB - Французская Коллекция Промышленных Дрожжевых Культур
ГенБанк - База данных GenBank NCBI
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ДНК - дезоксирибону клеиновая кислота
п.п. - пары нуклеотидов
Flolp — гликопротеин клеточной стенки Saccharomyces cerevisiae, ковалентно связанный с ß-1,6-гликанами и участвующий во флоккуляции клеток Ylcwpl - гликопротеин клеточной стенки Yarrowia lipolytica, ковалентно связанный с р-1,б-гликанами клеточной стенки
YlPirl - белок клеточной стенки Y. lipolytica, связанный посредством дисульфидных мостиков с гликопротеинами клеточной стенки

I. ВВЕДЕНИЕ
1. Актуальность темы
2. Цели и задачи работы
3. Научная новизна
4. Практическая значимость
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Разработанные системы для экспонирования белков на поверхности
КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ДРОЖЖЕЙ
1.1. Общая характеристика подхода
1.2. Гликопротеины, ковалентно связанные с Ь-1,6-гликаиами клеточной стенки, и С-концевой способ закрепления белков на поверхности клеток дрожжей
1.3. N-концевой способ иммобилизации белков на поверхности клеточной стенки
2. Промышленно-ценный фермент липаза
3. Существующие подходы к экспонированию липаз на поверхности клеточной
CTEHKII ДРОЖЖЕЙ
4. Аскол 1ИЦЕТНЫЕ ДРОЖЖИ Yarrowia lipolytica
5. Белки клеточной стенки и иммобилизация на поверхнос ти клеток дрожжей
Y. LIPOLYTICA
III. МАТЕРИАЛЛЫ И МЕТОДЫ
1. Штаммы, среды и условия культивирования
2. Выявление новых потенциальных белков клеточной стенки Y. lipol ytica
2.1. Выявление гомологов белка клеточной стенки дрожжей Y. lipolytica Ylcwpl
2.2. Выявление ближайшего гомолога белка клеточной стенки S. cerevisiae Flo Ip в дрожжах К lipolytica
3. Конструкция экспрессионных векторов
3.1. Создание вектора для суперэкспрессии липазы Lip2
3.2. Конструкция вектора для in vivo иммобилизации красного флуоресцентного белка с помощью белка клеточной стенки YIPirl
3.3. Конструкция вектора для in vivo иммобилизации липазы Lip2 с помощью белка клеточной стенки YIPirl
3.4. Конструкция вектора для in vivo иммобилизации липазы Lip2 с помощью N-домена предполагаемого гликопротеина клеточной стенки YAL10C09031p
3.5. Создание векторов для in vivo иммобилизации липазы Lip2 с помощью С-доменов гликопротеинов клеточной стенки
4. Методы генетической трансформации дрожжей
5. Микроскопия штамма с экспонированным на поверхности клеточной стенки красным ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ белком
6. Ферментация штаммов, продуцирующих липазу
7. Измерение липазной активности
8. Определение термостабильности свободной и иммобилизованной на клетках ЛИПАЗЫ
9. Получение клеток-биокатализаторов и изу чение стабильноспi закреплённой на их поверхности липазы
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Экспонирование красного флуоресцентного белка TurboFP635 на поверхности КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ Y. LIPOLYT1CA
2. Получение штамма-продуцента секретируемой липазы Lip2
3. Экспонирование липазы Lip2 на поверхности клеточной стенки дрожжей
Y. LIPOLYTICA С ПОМОЩЬЮ N-КОНЦЕВОГО СПОСОБА ЗАКРЕПЛЕНИЯ
3.1. Скрининг полученных трансформантов
3.2. Ферментация отобранных штаммов
4. ЭКСПОНИРОВАНИЕ ЛИПАЗЫ Lip2 на поверхности клеточной стенки дрожжей
Y. LIPOLYTICA С ПОМОЩЬЮ С-ДОМЕНОВ БЕЛКОВ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ
4.1. Скрининг полученных трансформантов
4.2. Ферментация отобранных штаммов
5. Изучение термостабильности клеточно-связанной липазы
6. Получение клеток-биокатализаторов и изучение стабильности закреплённой на их поверхности липазы
V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
VI. ВЫВОДЫ
VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

рУ-1ЛР2-Сс1от поверхности клеток с помощью С-домена предполагаемого гликопротеина клеточной стенки УАЫ0С09031р, участвующего в процессе адгезии
pY-LIP2-YlCWPl-94 ИМЭ вектор для экспонирования липазы 1лр2 на поверхности клеток с помощью С-домена гликопротеина клеточной стенки У1сур1
рУ-ЫР2-У1СУР2-34 ИМЭ вектор для экспонирования липазы 1лр2 на поверхности клеток с помощью С-домена предполагаемого гликопротеина клеточной стенки У1смр2
pY-LIP2-YlCWPЗ-121 ИМЭ вектор для экспонирования липазы 1лр2 на поверхности клеток с помощью С-домена предполагаемого гликопротеина клеточной стенки У1с\'рЗ
р У-ЫР2-У1С'УР4-129 ИМЭ вектор для экспонирования липазы 1лр2 на поверхности клеток с помощью С-домена предполагаемого гликопротеина клеточной стенки У1сур4
pY-LIP2-YlCWP5-168 ИМЭ вектор для экспонирования липазы 1лр2 на поверхности клеток с помощью С-домена предполагаемого гликопротеина клеточной стенки У1слур5
рУ-ЫР2-У1С WPб-139 ИМЭ вектор для экспонирования липазы 1лр2 на поверхности клеток с помощью С-домена предполагаемого гликопротеина клеточной стенки У1с\р6