Конструирование продуцентов рекомбинантных белков Р72, Р30 и Р54 вируса африканской чумы свиней

• Автор: Казакова, Анна Сергеевна
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Покров
• Количество страниц: 135 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1 ВВЕДЕНИЕ
1.1 Актуальность работы
1.2 Степень разработанности проблемы
1.3 Цели и задачи исследования
1.4 Научная новизна результатов исследований
1.5 Теоретическая и практическая значимость работы
1.6 Апробация результатов работы
1.7 Соответствие диссертации паспорту научной специальности, по
которой она рекомендуется к защите
1.8 Публикации
1.9 Объем и структура диссертации
1.10 Основные положения, выносимые на защиту
1.11 Личный вклад автора в выполнение работы
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Африканская чума свиней: историческая справка и проблемы 15 иррадикации
2.2 Структура вируса АЧС
2.3 Свойства белков вируса АЧС
2.4 Использование рекомбинантных белков в разработке 30 современных средств диагностики и специфической профилактики АЧС
2.5 Заключение по обзору литературы
3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Материалы
3.1.1 Штаммы вируса АЧС
3.1.2 Препараты вирусной ДНК
3.1.3 Плазмидные векторы и бактериальные штаммы
3.1.4 Культуры клеток

3.1.5 Образцы патологического материала
3.1.6 Сыворотки крови
3.1.7 Моноклональные антитела
3.1.8 Антигены
3.1.9 Животные
3.1.10 Растворы и реактивы
3.1.11 Лабораторное оборудование
3.2 Методы
3.2.1 Молекулярно-биологические исследования
3.2.2 Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных 44 последовательностей
3.2.3 Методы белкового анализа
3.2.4 Получение специфических сывороток к рекомбинантным 45 белкамрЗО ир54 вируса АЧС
3.2.5 Иммуноферментный анализ (ИФА)
3.2.6 Постановка реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ)
3.2.7 Постановка реакции задержки гемадсорбции (РЗГАд)
3.2.8 Статистическая обработка результатов исследований
3.3 Результаты собственных исследований
3.3.1 Клонирование и экспрессия генов В646Ь (р72), СР204Ь (рЗО) и 47 Е183Ь (р54) вируса А ЧС
3.3.1.1 Подбор праймеров и оптимизация условий ПЦР для синтеза 48 полноразмерных копий генов В646Ь, СР204Ь и Е183Ь вируса АЧС
3.3.1.2 Клонирование гена В646Ь вируса АЧС и его центрального
фрагмента
3.3.1.3 Клонирование гена СРЮ 48 вируса А ЧС
3.3.1.4 Клонирование гена Е183Ь вируса АЧС
3.3.1.5 Конструирование продуцентов полноразмерного
рекомбинантного белка р72 и его конформационного эпитопа (р72е)

3.3.1.6 Конструирование продуцентов рекомбинантного белка рЗО
3.3.1.7 Конструирование продуцентов рекомбинантного белка р54
3.3.1.8 Экспрессия генов B646L, CP204L и E183L в E. coli
3.3.1.9 Очистка рекомбинантных белков р72, р72е, рЗО ир54
3.3.2 Изучение возможности использования рекомбинантных белков 76 р72 up72е в диагностических целях
3.3.3 Усовершенствование продуцента конформационного эпитопа 77 рекомбинантного белка рЗО (Rec рЗОе)
3.3.4 Изучение возможности использования рекомбинантных белков 79 р72е и рЗОе в диагностике А ЧС
3.3.5 Получение моноспецифических сывороток к рекомбинантным 83 белкам рЗО, рЗОе и р54 и изучение их свойств
3.3.5.1 Использование рекомбинантных белков рЗО, рЗОе и р54 для 83 получения моноспецифических сывороток
3.3.5.2 Изучение биологических свойств моноспецифических сывороток 87 крЗО и р54 in vitro
3.3.6 Филогенетический анализ нуклеотидных
последовательностей генов CP204L uE183L
3.4 Обсуждение собственных исследований
4 ВЫВОДЫ
5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
6 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ

В первых опытах P. Gomez-Puertas и соавт. (1996) по иммунизации свиней рекомбинантными белками р54 и рЗО после контрольного заражения в дозе 100 ГАЕ на голову вирулентным штаммом Е70 выжили 50% животных [146], в то время как в опытах J.G. Neilan и соавт. (2004) не оказалось свиней, иммунизированных рекомбинантными р72, рЗО и р54, устойчивых к контрольному заражению вирулентным вирусом Рг4 в дозе 104 ТЦД50 на голову [145].
Очевидно, что быстрое развитие инфекционного процесса при большой дозе введенного вируса и наличие антител, маскирующих вирус, смогли опередить развитие протективного ответа и обойти те защитные механизмы, которые формировалось при иммунизации тремя рекомбинантными белками.
Хотя данные J.G. Neilan и соавт. (2004) показали недостаточность совместного введения рЗО, р54 и р72 для создания протективного иммунного ответа [145], в более ранней работе M.G. Barderas и соавт. (2001) установили, что защита против АЧС может быть достигнута с помошью химерного протеина р54/30 от контрольного заражения вирулентным вирусом Е75, прошедшим 4 пассажа на клетках CV-1 [62].
Для 5-кратной иммунизации свиней использовали химерный белок р54/30 в дозе 100 мкг/гол. После пятой инъекции титры антител составляли 1:200. При заражении свиней Е75 внутримышечно в дозе 500 ЛДюо не вакцинированные животные пали на 6-е сут с характерными клиническими признаками АЧС [62], а у свиней, иммунизированных химерным белком р54/30, титры вируса в крови были в 50-100 раз ниже, чем в контрольной группе. Животные оставались клинически здоровыми в течение 55 сут, после чего были убиты, а пробы их крови, селезенки, почек и лимфатических узлов исследовали с помощью ПЦР. Во всех образцах ДНК вируса АЧС не обнаружили [62].
В 2012 году J.M. Argilaguet и соавт. сконструировали рекомбинантную плазмиду, кодирующую вирусные детерминанты sHA, р54, рЗО и убиквитин [91]. Показано, что иммунизация pCMV-UbsHAPQ индуцировала специфический Т-клеточный иммунный ответ при отсутствии антител и повысила процент