Механизмы агрегации мутантных белков в моделях болезни Хантингтона и амиотрофического бокового склероза

• Автор: Лазарев, Владимир Федорович
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 114 с. : ил.

1. ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ОГЛАВЛЕНИЕ
2. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
3. ВВЕДЕНИЕ
4. ЦЕЛИ ИЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
5. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
6. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
6.1. Общие сведения о нейродегенеративных заболеваниях
6.2. Нейродегенеративные заболевания, связанные с накоплением белков
с длинными полиглутаминовыми последовательностями
6.3. Болезнь Хантингтона
1.3.1. Нерастворимые внутриклеточные агрегаты и их роль в патогенезе болезни Хантингтона
1.3.2. Белки, принимающие участие в формировании агрегатов с участием мутантного хантингтина
1.3.3. Гипотезы формирования белковых агрегатов при БХ
6.4. Амиотрофический боковой склероз
6.4.1. Супероксиддисмутаза-1 как причина возникновения АБС
6.4.2. Общие сведения о СОД-
6.4.3. Образование белковых агрегатов при амиотрофическом боковом склерозе
6.5. Тканевая трансглютаминаза и ее роль в патогенезе болезни Хантингтона
6.5.1. Семейство трансгутаминаз
6.5.2. Структура и функции тканевой трансглутаминазы
6.5.3. Роль тканевой трансглютаминазы в болезни Хантингтона
6.6. Глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа и ее роль в патогенезе
болезни Хантингтона
6.6.1. Структура ГАФД
6.6.2. Функции ГАФД
6.6.3. Локализация ГАФД в клетке
6.6.4. Про-апоптотический белок ГАФД
6.6.5. Участие ГАФД в патогенезе нейродегенеративных заболеваний
1.6.1. Роль ГАФД в болезни Хантингтона
6.7. Влияние тканевой трансглютаминазы на фермент ГАФД
6.8. Вещества, способные связывать ГАФД или препятствовать агрегации мутантных полиглутаминовых белков
6.9. Молекулярный шаперон БТШ70 и его роль в нейродегенерации
6.9.1. Семейство БТШ70 и его функции в клетке
6.9.2. Защитное действие БТШ70 в «полиглутаминовых» заболеваниях
7. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
7.1. Культивирование клеток
7.2. Белки и пептиды
7.3. Трансфекция клеток
7.4. Агрегация белков в бесклеточной системе
7.5. Анализ агрегации в клетках, экспрессирующих патогенный белок
7.6. Система на основе очищенных белков и пептидов
7.7. Определение субстрат-связывающей (шаперонной) активности
7.8. Анализ межбелковых взаимодействий
7.9. Метод ловушки на фильтре (Filter trap assay)
7.10. ГГААГ-ДСН электрофорез и иммуноблоттинг
7.11. Модификация ДСН-ПААГ электрофореза для анализа ДСН-нерастворимой клеточной фракции - электрофорез с задержкой в геле
7.12. Иммунопреципитация
7.13. Определение активности дегидрогеназ по Мосману

7.14. Атомно-силовая микроскопия
7.15. Динамическое светорассеяние
7.16. Визуальная оценка уровня агрегации
7.17. Статистическая обработка результатов
8. РЕЗУЛЬТАТЫ
8.1. Уровень агрегации мутантного хантингтина определяется количеством ГАФД
8.2. ГАФД участвует в формировании агрегатов в модели АБС
8.3. Подавление экспрессии ГАФД вызывает задержку процесса агрегации
и снижение цитотоксичности в модели БХ
6.10. Роль трансглутаминазы в формировании связей между ГАФД и
белками-виновниками патогенеза БХ и АБС
8.4. Разработка основанной на очищенных белках тест-системы для скрининга препаратов на предмет их антиагрегатную активность..
8.5. Пробный скриннинг низкомолекулярных факторов с использованием новой тест-системы
8.6. БТШ70 предотвращает агрегацию в модели БХ, связывая и ГАФД, и полиглутамин
8.7. Шаперон БТШ70 использует различные механизмы для предотвращения участия ГАФД и полиглутамина в процессе агрегации
8.8. Лекарственное прекондиционирование активирует шаперонный аппарат клетки
9. ОБСУЖДЕНИЕ
10. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
11. ВЫВОДЫ
12. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ..

13. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

• Г АФД участвует в предотвращении каспаза-независимой клеточной смерти (может быть вызвана митохондриальными нарушениями, в том числе, пермеабилизацией внешней мембраны) (Rathmell, Kornbluth, 2007).
• ГАФД специфически связывается с теломерными участками ДНК, защищая их от сокращения во время репликации. Специфически взаимодействует с эндонуклеазой АРЕ-1 (ферментом участвующим в восстановлении поврежденной ДНК), способен восстанавливать ее из окисленной формы в активную (Azam et al., 2008)
6.6.3. Локализация ГАФД в клетке Преимущественно ГАФД находится в цитоплазме в связи с мембраной или цитоскелетом, где он связан с кофактором НАД+. Фермент может также находиться в клеточном ядре в виде мономера преимущественно во время пролиферации клеток (Corbin et al., 2002). ГАФД при этом может участвовать в процессах репликации и репарации ДНК. Фермент встречается и на поверхности мембран некоторых клеток, выполняя рецепторную функцию (Raje et al., 2007). Внутриклеточная локализация ГАФД может изменяться в течение таких процессов и явлений, как пролиферация клеток, окислительный стресс или апоптоз (Mazzola, Sirover, 2001).
6.6.4. Про-апоптотический белок ГА ФД В последнее время активно изучается роль ГАФД в нейрональном апоптозе. Стабильность тетрамерной формы ГАФД достигается за счет ионных взаимодействий между положительно заряженным НАД+ и отрицательно заряженными сульфатными группами на активных сайтах фермента (Cysl49). Химические модификации цистеиновых остатков приводят к дестабилизации четвертичной структуры фермента. Вследствие
чего, ГАФД распадается на димеры, мономеры (Carlile et al., 2000; Arutyunov,