Динамика образования и элиминации фосфорилированного гистона Н2АХ в клетках млекопитающих после рентгеновского облучения

• Автор: Фирсанов, Денис Владимирович
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 125 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений

Введение

I. Обзор итературы

1. Индукция и репарация двунитевых разрывов ДНК

1.1. Сложные повреждения ДНК

1.2. Двунитевые разрывы ДНК: простой случай сложных

повреждений

1.3. Репарация путем гомологичной рекомбинации

1.4. Негомологичное воссоединение концов

2. Динамика хроматина и репарация двунитевых разрывов ДНК
2.1. Структура хроматина
2.2. Структура хроматина и репарация двунитевых разрывов ДНК
2.3. Дестабилизация хромосом способствует убикитинированию хроматина
3. Фосфорилирование Н2АХ в сайтах двунитевых разрывов ДНК в культивируемых клетках млекопитающих и тканях
3.1. Протеин киназы, вовлеченные в фосфорилирование Н2АХ.
3.2. Механизмы индукции и дефосфорширования у-Н2АХ во время репарации двунитевых разрывов ДНК
3.3. Локализация фокусов у-Н2АХ в контексте хроматина
3.4. Кинетика фосфорилирования/дефосфорилирования Н2АХ в культивируемых клетках млекопитающих
3.5. Фосфорилирование Н2АХ после малых доз ионизирующего облучения
3.6. «Эффект свидетеля» после облучения
3.7. Фосфорилирование Н2АХ в тканях мышей после генотоксических стрессов
II. Материалы и методы
1. Линии клеток
2. Пациенты
3. Выделение лимфоцитов из периферической крови человека
4. Работа с материалом от экспериментальных животных
5. Рентгеновское облучение
6. Иммунофлуоресцентный и иммуногистохимический анализ
6.1. Не прямой иммунофлуоресценцентный анализ
6.2. Не прямой иммуногистохимический анализ
6.3. Приготовление отпечатков тканей, фиксация и иммуногистохимиядляконфокалъноймикроскопии
7. Иммуноблоттинг
8. Приготовление метафазных пластинок хромосом
9. ПЦР в реальном времени
10. Микроскопический анализ
III. Результаты и обсуждения
1. Исследование фокусов уН2АХ в клеточных культурах после рентгеновского облучения
2. Форсколин снижает уровень фосфорилирования гистона Н2АХ в клетках человека после ионизирующего облучения
3. Фосфорилирование гистона Н2АХ в лимфоцитах человека
4. Межтканевые вариации в эффективности фосфорилирования гистона Н2АХ у мышей С57В1 после рентгеновского облучения
5. Динамика образования и элиминации уН2АХ в тканях сирийского хомячка после рентгеновского облучения
6. Однократное внутрибрюшинное введение мышам НАДФ+ приводит к увеличению уровня уН2АХ в сердце после рентгеновского облучения
животных
Заключение

Выводы
Список литературы

концентрации факторов MRN и ATM в поврежденных сайтах (Yuan, Chen, 2010). Н2АХ-независимое узнавание ДР возможно вовлечено в минорный путь воссоединения ДР, который обладает малой эффективностью и объяснет умеренную нестабильность генома в ШАХ -/- мышах. Главный путь репарации ДР является уШАХ-зависимым процессом, и по всей видимости уШАХ играет роль в модулировании репарации ДНК в обоих путях НВК и ГР (Bassing et al., 2002; Shrivastav et al., 2008). С другой стороны, образование уШАХ может быть не строго ассоциировано с индукцией ДР в ДНК. Образование фокусов уН2АХ наблюдается в отсутствие ДР во время клеточного старения индуцированного ингибированием гистоновой деацетилазы бутиратом натрия, которое сопровождается активацией специфических белков вовлеченных в клеточное старение р21 или р16. Такой псевдо ответ клеток на повреждения может защищать стареющие клетки от их входа в митоз (Pospelova et al., 2009).
3.1. Протеин киназы, вовлеченные в фосфорилирование ШАХ.
В фосфорилировании ШАХ в местах ДР вовлечены киназы ATM, ATR и DNA-PK. ШАХ, локализованный в доменах хроматина вокруг ДР вызванных ИР, фосфорилируется ATM и DNA-PK, однако уровни фосфорилирования, которые наблюдали различные исследователи в клетках человека и мыши дефектных по ATM или DNA-PK сильно различаются. ATM рекрутируется в места ДР и активируется комплексом MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) (Berkovich et al., 2007). В отсутствие ДР киназа ATM неактивна и представляет из себя димер, после ИР происходит аутофосфорилирование киназы по серинам 367, 1983 и 1981, после чего димер диссоциирует и его субъединицы становятся активными (Iijima et al., 2008). Результаты, полученные группой Burma в 2001 году выявили ATM как главную киназу в фосфорилировании Н2АХ в мышиных эмбриональных фибробластах после действия ИР. В фибробластах полученных от мышей нокаутных по гену