Регуляция транскрипции генов теплового шока у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Еркин, Александр Михайлович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 175 с. : ил.

ОГ ДАВЛЕНИЕ
1. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ
2. ВВЕДЕНИЕ
3. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
4. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
4.1. Хроматин и ремоделирование хроматина
4.1.1. Общая структура хроматина
4.1.2. Нуклеосома
4.1.3. Динамика хроматина
4.1.4 Активация транскрипции в контексте хроматина
4.2. Роль гистонов в хроматине
4.2.1. Общая информация о гистонах
4.2.2. Варианты гистонов
4.2.3. Гипотеза «гистонового кода»
4.3. Модификации гистонов
4.3.1. Ферменты, модифицирующие гистоны
4.3.2. Механизмы действия гистоновых модификаций
4.3.3. Функциональные последствия гистоновых модификаций
4.4. Современные представления об АТФ-зависимом ремоделировании
4.4.1. АТФ-зависимые комплексы, ремоделирующие хроматин
4.4.2. Механизмы действия АТФ-зависимых комплексов, ре моделирующих хроматин
4.4.3. Требования к субстрату
4.4.4. Внутринуклеосомное образование петель
4.4.5. Гипотеза «позиционного кода»
4.5. АТФ-зависимые комплексы, ремоделирукнцие хроматин от дрожжей до человека
4.6. Функционирование транскрипционных активаторов в контексте хроматина
4.6.1. Характеристики и парадоксы активационных доменов
4.7. Заключение
5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

5.1. Материалы
5.1.1. Штаммы 5. сегегіхіае, использованные в работе
5.1.2. Антитела, использованные для иммунопреципитации хроматина
5.1.3. Праймеры для количественной 1ТЦР в реальном времени
5.2.Метод ы
5.2.1.Условия культивирования
5.2.2. Процедура теплового шока
5.2.3. Геномный футпрпнтинг с использованием ДНКазы
5.2.4. Геномный футпринтингс использованием ДМС
5.2.5. Блоттинг по Нозерну
5.2.6. Создание геномной библиотеки и проведение скрининга на выявление
последовательностей, функционирующих как активационные домены
5.2.7. Конструирование плазмид
5.2.8. Определение Р-галактозпдазной активности
5.2.9. Компьютерный анализ ДНК и белков
5.2.10. Иммунопреципитация хроматина (СЫР)
5.2.10.1. Приготовление клеточного экстракта
5.2.10.2. Иммунопреципитация
5.2.10.3. Количественная ПЦР в реальном времени
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
6.1. Механизмы конститутивной и индуцибельной экспрессии генов
Н8Р82 и НБС
6.1.1. Введение к экспериментальной части
6.1.2. Высокий конститутивный уровень экспрессии гена НБС82 определяется стабилизацией основного активатора НБГ с помощью дополнительного фактора СКР
6.1.3. Дслеция НвЕІ приводит к стабилизации нуклеосом на промоторе гена ЯУС
6.1.4. Высокая индуцибельность гена Н8Р82 определяется множественностью последовательностей НБЕ и кооперативным взаимодействием с ними молекул НБР на промоторе этого гена

6.1.5. HSF взаимодействует кооперативно с множественными HSE in vivo
6.1.6. HSF взаимодействует кооперативно с множественными HSE in vitro
6.2. Динамические изменения структуры хроматина, инициируемые
природными и синтетическими активационными доменами
6.2.1. Введение
6.2.2. При тепловом стрессе на промоторах генов теплового шока происходит удаление гистонов
6.2.3. Короткие пептидные последовательности могут функционально замещать большой С-концевой активационный район HSF
6.2.4. Идентификация и характеристика фрагментов, комплементирующих температурочувствительный фенотип С-концевой делеции HSF
6.2.5. Активационные потенциалы синтетических активационных доменов не носят специфический характер относительно контекста промоторов или транскрипционных факторов
6.2.6. Промотороры GAL генов претерпевают модификации хроматина, зависящие от природы синтетических активационных доменов
6.2.7. Гистоны являются потенциальными мишенями активационных доменов (АД)
6.2.8. Обсуждение результатов
6.2.8.1. Промотор-специфические транскрипционные факторы инициируют значительные модификации хроматина на соответствующих промоторах
6.2.8.2. С-терминальный домен фактора теплового шока, величиной в 340 аминокислот, может быть функционально заменен пептидами, размером всего 11 аминокислот
6.2.8.3 Г истоны являются мишенями активационных доменов
6.2.8.4. Рекрутирование комплексов ремоделирования хроматина и модификаций гистонов с помощью активационных доменов
6.2.8.5. Модели прямого рекрутирования
6.2.8.6. Модели непрямого рекрутирования
6.2.8.7. Модель непрямого рекрутирования, включающая взаимодействие между АД и гистонами
6.2.8.8. Сосуществование моделей прямого и непрямого рекрутирования...!

4.4.3. Требования к субстрату
АТФ-зависнмые ремоделирующие комплексы обладают сходными свойствами в отношении гидролиза АТФ при взаимодействии с хроматином (Boyer et al., 2000; Brzeski and Jerzmanowski, 2003), но не в том случае, если субстратом является открытая ДНК или концевые домены гистонов. У дрожжевых субъединиц Swi2 и Still активность АТФ-аз максимально стимулируется свободной ДНК, тогда как, добавление нуклеосом не оказывет никакого эффекта (Boyer et al., 2000). ISWI и INO80 стимулируются свободной ДНК. но максимальный эффект наблюдается в присутствии нуклеосом (Boyer et al., 2000) (Tsukiyama and Wu, 1995; Jin et al., 2005). ISWI связывается с нуклеосомами, если в них имеется свободная ДНК, но если при этом доступны N-терминальные концы гистона Н4, то активность комплекса будет максимальной (Clapier et al., 2001). В противоположность, активность dMi-2 (CHD -тип) более выражена, если отсутствует свободная ДНК. В случае сели присутствует даже небольшое количество никированной ДНК, активность dMi-2 очень незначительна (Boyer et al., 2000; Brehm et al., 2000). Очевидно неизвестно какое количество сайтов взаимодействий с ДНК и гистонами задействовано при работе комплексов, ремоделирующие хроматин. В дрожжевом RSC комплексе (SWI/SNF тип) шесть его субъединиц связываются со свободной или уже ремоделированной ДНК, но только четыре связаны с нуклеосомой непосредственно до ремоделированпя (Sengupta et al., 2001). Известно, что RSC и SWI/SNF связываются с нуклеосомной коровой частицей, в то время как ISWI не только связывается с коровой частицей, но еще и с линкерной ДНК (Saha et al., 2005; Zofall et al., 2006).
Несмотря на то, что АТФ-азные субъединицы всех комплексов, ремоделирующих хроматин имеют структурную гомологию с хеликазами, нет данных о том, что они проявляют хеликазную активность, и о том, что в течении ремоделирования появляются участки одноцепочечной ДНК (Cote et al., 1994; Quinn et al., 1996). INO80, однако, проявляет хеликазную активность (Shen et al., 2000), которая обусловлена присутствием двух RuvB подобных хеликазных субединиц в комплексе.
4.4.4. Внутринуклеосомное образование петель
Внутринуклеосомное образование петель наиболее изученная и, на настоящий момент, наиболее предпочтительная модель, описывающая механизм ремоделированпя хроматина. Связывание с ДНК одновременно в двух положениях позволяет