Влияние фактора некроза опухоли на цитотоксичность и индукцию апоптоза противоопухолевыми препаратами на клеточных линиях меланом. Экспериментальное исследование

• Автор: Бигвава, Хьыбла Амерановна
• Шифр специальности: 14.01.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 128 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Цитокины - фактор некроза опухоли-а
Глава 2. Клеточные культуры как модель
экспериментальной онкологии
Глава 3. Характеристика индукции апоптоза и белки, контролирующие этот процесс в клетке
ЧАСТЬ И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 1. Материалы
Глава 2. Методы исследования
2.1. Определение цитотоксической активности
МТТ-тест
2.2. Метод фиксированного окрашивания ДНК пропидий йодидом (PI) для определения апоптотических клеток.
2.3. Метод двойного прижизненного окрашивания ДНК с использованием Аннексина V-FITC в комбинации с PI
2.4. Реакция прямой иммунофлюоресценции
2.4.1. Окрашивание поверхностных антигенов
2.4.2. Окрашивание внутриклеточных маркеров
2.5. Проточно-цитофлюориметрический анализ
2.6. Статистическая обработка результатов
ЧАСТЬ III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 1. Цитотоксическое действие противоопухолевых препаратов в сочетании с альнорином на клеточных линиях меланом человека in vitro
1.1. Цитотксичность ACNU на клеточных линиях меланом в сочетании с альнорином

1.2. Цитотксичность аранозы на клеточных линиях меланом в сочетании с альнорином.
1.3. Цитотксичность BCNU на клеточных линиях меланом в сочетании с альнорином.
1.4. Цитотксичность DTIC на клеточных линиях меланом в сочетании с альнорином.
Глава 2. Исследование in vitro на клеточных линиях меланом лекарственно-индуцированного апоптоза противоопухолевыми препаратами в сочетании с альнорином.
2.1. Определение влияния альнорина на индукцию апоптоза BCNU на клеточных линиях меланом методом фиксированного окрашивания ДНК.
2.2. Определение влияния альнорина на индукцию апоптоза DTIC на клеточных линиях меланом методом фиксированного окрашивания ДНК.
2.3. Определение влияния альнорина на индукцию апоптоза BCNU на клеточных линиях меланом методом двойного прижизненного окрашивания ДНК.
2.4. Определение влияния альнорина на индукцию апоптоза DTIC на клеточных линиях меланом методом двойного прижизненного окрашивания ДНК.
Глава 3. Изучение экспрессии CD95 и белков группы bcl-2 на клеточных линиях меланом
3.1. Экспрессия CD95 на клеточных линиях меланом
3.2. Экспрессия молекулярно-биологических маркеров семейства bcl-2 на клеточных линиях меланом
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ВЫВОДЫ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ
Меланома кожи является одной из агрессивных форм злокачественных опухолей, обладающей высокой потенцией местного роста, регионарного метастазирования, способностью к диссеминации по коже, множественному метастазированию. Развитие метастазов в лимфатической системе наблюдается в 70% случаев меланомы, обычно поражаются печень, легкие, мозг и костная ткань. Именно метастазирование на ранних стадиях обусловливают высокую смертность и неэффективность терапии данного заболевания [Плешкан 2011].
Несмотря на достижения последних десятилетий, лечение меланомы кожи остается крайне трудной проблемой. С одной стороны, наружная локализация опухоли, возможность радикального лечения ранних стадий, высокая иммуногенность позволяют рассчитывать на успех в лечении. С другой - высокая частота рецидивов, непредсказуемость клинического течения заболевания и отсутствие эффективности системной терапии делают пессимистичными прогнозы при возникновении прогрессирования болезни [Новик A.B., 2011].
У каждого десятого больного меланому выявляют в IV стадии, когда уже имеет место инвазия и метастазирование, и методом лечения является химиотерапия с использованием дакарбазина, производных нитрозомочевины и платины. Эффективность такой терапии остается низкой из-за высокой резистентности клеток меланомы и/или быстрой индукции множественной лекарственной устойчивости при воздействии противоопухолевых препаратов [Serrone L. et al., 1999; Helmbach H. et al., 2003].
Среднегодовой темп прироста заболеваемости меланомой в мире составляет около 5% (в США — 4%, в России — 3,9%) и может считаться одним из самых высоких среди всех злокачественных опухолей, после рака легкого. Ежегодно в нашей стране выявляется около 8000 пациентов с диагнозом меланома кожа. [Давыдов М.И., 2009].
оценки количества апоптотических клеток использовали апоптотический индекс (АИ), который вычисляли по формуле:
число положительно окрашенных клеток
АИ = х 100%
общее количество клеток
2.3. Метод двойного прижизненного окрашивания ДНК с использованием Аннексииа V-FITC в комбинации с PI.
Клетки выращивали в лунках 6-луночных планшетов (Costar), засевая их по 2 мл клеточной суспензии, содержащей 5x104 клеток/мл. После инкубации клеток с препаратом, ФНО-а и их сочетанием, а также интактные клетки собирали раствором Версена без фиксации, осаждали центрифугированием 5 минут при 1000 оборотов/минуту. Клетки дважды отмывали в фосфатном буфере (PBS), а затем добавляли 100 мкл связывающего буфера, 5 мкл Аннексии V-FITC и 5 мкл пропидий йодид (PI -5 мкг/мл). Образцы встряхивали на вортексе и инкубировали в темноте 15 минут при комнатной температуре. Затем к пробам добавляли 400 мкл связывающего буфера и производили анализ на проточном цитофлюориметре.
2.4. Реакция прямой иммунофлюоресценции.
2.4.1. Окрашивание поверхностных антигенов.
Экспрессию CD95 антигена исследовали в реакции поверхностной иммунофлюоресценции. Для этого 100 мкл 5x1 O'1 клеток с 20 мкл МКА, конъюгированных с РЕ инкубировали в течение 30 мин при 4°С. По окончании инкубации к клеткам добавляли 2 мл PBS, отмывали 5 мин. при 1000 оборотах/минуту. После этого осадок клеток ресуспендировали в 300 мкл 1% раствора формалина и анализировали на проточном цитофлюориметре.