Получение, характеристика и генетическая модификация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток крысы для применения в целях тканезаместительной терапии

• Автор: Лисковых, Михаил Александрович
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 134 с. : ил.

Содержание
Введение
I. Обзор литературы
1.1. Эмбриональные стволовые клетки
1.1.1. Основные сигнальные пути, обеспечивающие самообновление клеток и поддержание плюрипотентного состояния в ЭС клетках
1.1.1.1. LIF/gp 130/STAT3 - сигнальный путь
1.1.1.2. BMP/Smad каскад
1.1.1.3. Wnt/p-Catenin/TCF
1.1.1.4. Фосфотидилинозитол-3 (PI3) киназный сигнальный путь
1.1.1.5. Ras/Raf/ERK сигнальный путь
1.1.1.6. Перекрещивание и совместное действие сигнальных путей
1.1.2. Ключевые транскрипционные факторы, характерные для ЭС клеток, обеспечивающие контроль самоподдержания и плюрипотентного состояния

1.1.2.2. Nanog

1.1.3. Эпигенетический статус ЭС клеток
1.1.4. Влияние химически-синтезированных веществ на ЭС клетки
1.2. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки
1.2.1. Предпосылки открытия феномена индуцированной плюрипотентности
1.2.2. Открытие феномена индуцированной плюрипотентности
1.2.3. Необходимые характеристики иПС клеток
1.2.3.1. Способы доставки репрограммирующих факторов в клетки: интегрирующие системы
1.2.3.2. Способы доставки репрограммирующих факторов в клетки: неинтеграрующие системы
1.2.3.3. Идентификация иПС клонов
1.2.4. Механизмы, лежащие в основе формирования иПС клеток
1.2.4.1. Детерминистическая и стохастическая гипотезы перехода соматических клеток в плюрипотентное состояние
1.2.4.2. Предполагаемая последовательность событий при переходе клеток в плюрипотентное состояние
1.2.5. Роль репрограммирующих транскрипционных факторов в процессе перестройки хроматина
1.2.6. Перспективы использования иПС клеток в терапевтических целях
II Материалы и методы
II. 1. Работа с клетками эукариот в культуре
И.1.1. Получение МЭФ из 13.5-дневных плодов мыши
II. 1.2 Обработка МЭФ митомицином
II. 1.3. Культивирование ЭС клеток мыши
II. 1.4. Трансфекция кальций-фосфатным методом
II. 1.5. Упаковка вирусных частиц
II. 1.6. Титрование вирусов
II. 1.7. Заражение клеток лентивирусными частицами
И. 1.8. Модификации пластика для культивирования
II. 1.9. Получение иПС клеток крысы
II. 1.10 Получение иПС клеток мыши
II. 1.11 .Электропорация ЭС клеток мыши и иПС клеток крысы
II. 1.12. Клональный анализ

II. 1.13. Реакция на щелочную фосфатазу
II. 1.14. Тест на формирование тератом
II. 1.15. Дифференцировка иПС клеток крысы in vitro
II. 1.16. Инъекция иПС клеток в эмбрион крысы
11.2. Молекулярно-биологические методы
11.2.1. Генотипирование клонов ЭС (иПС) клеток
11.2.2. Кариотииирование ЭС (иПС) клеток
11.2.3. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток, находящихся в культуре
11.2.4. Реакция обратной транскрипции
11.2.5. Полимеразная цепная реакция
11.2.6. LacZ-окрашивание
И.2.7. Проточная цитофлуореметрия (FACS)
II.2.8 Молекулярное клонирование
III. Результаты и обсуждения
III. 1. Получение иПС клеток крысы
III. 1.1. Индукция плюрипотентного состояния в КЭФ
III. 1.2. Доказательства плюрипотентного статуса полученных иПС клеток крысы
III. 1.3. Особенности условий культивирования иПС клеток крысы
III. 1.4. Проведение генетических манипуляций с иПС клетками крысы
III. 1.5. Подбор условий для направленной дифференцировки иПС клеток крысы
III. 1.6. Обсуждение
111.2. Метод генетической сенсибилизации
111.2.1. Создание ДНК конструкций для генетической сенсибилизации
111.2.2. Генетическая сенсибилизация через введение «маркера-самоубийцы»
111.2.3. Мечение ТК-ЭС/иПС клеток
111.2.4. Пример использования генетической сенсибилизации в терапевтических целях
111.2.4.1. Участие суицидальных ТК-ЭС клеток в восстановлении функций повреждённой поджелудочной железы
111.2.4.2. Участие суицидальных ТК-ЭС клеток в восстановлении гематопоэза у летально облучённых мышей
III.2.5.Обсуждение
Выводы
Литература
Приложение

Введение
В последнее время всё более возрастает потребность в новых экспериментальных моделях. В первую очередь это касается тех областей науки, которые близки к терапевтическим медицинским исследованиям. Одной из актуальных задач исследований, проводимых на стыке биологии и медицины, является выбор модельного организма. Крыса представляет собой удобную модель в физиологии, фармакологии, трансплантологии, иммунологии, онкологии, и изучении старения и сердечно-сосудистой системы. При сравнимой с мышиной продолжительностью репродуктивного цикла и стоимостью содержания, крыса имеет более подходящий размер, например, для рутинного отбора проб крови и сложных физиологических опытов. С другой стороны, полное понимание физиологических процессов невозможно без описания функции генов, что в свою очередь должно опираться на генный нокаут. Проведение генного нокаута на мыши стало возможным только благодаря возможности получения эмбриональных стволовых (ЭС) клеток (Evans et al., 1981). Однако проведение генного нокаута на крысе до недавнего времени не представлялось возможным, так как ЭС клетки этого вида были впервые получены только в 2008 году (Buehr et al., 2008). Помимо прочего, процесс их получения оказался очень трудоёмким и дорогостоящим.
Таким образом, получение индуцированных плюрипотентных стволовых (иПС) клеток крысы позволит обойти особо трудоёмкий процесс получения ЭС клеток и приблизит нас к проведению различных исследований, использующих крысу, как экспериментальную модель.
Эмбриональные стволовые клетки и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки обладают рядом уникальных особенностей: способны неограниченно долго делиться в культуре, а также подвергаться генетическому манипулированию, сохраняя свои свойства. Путём изменения условий культивирования можно добиваться дифференцировки ЭС/иПС клеток in vitro практически во все клеточные типы тканей

Таблица 1.
Получение иПС клеток от различных видов, используя различные исходные клеточные типы (по Stadtfeld and Hochedlinger, 2010 с изменениями).
Вид Зародышевый листок Тип клеток Факторы Эффективность Источник
Мышь Мезодерма Фибробласты OKSM 0.02 Takahashi and Yamanaka, 2006
OKS 0.002 Nakagawa et al. 2008; Wernig et al
OSE ND Feng et al
KSNr 0.002 Heng et al
В-лимфоциты OKSM+ С 3% Hanna et al
Т- и В- лимфоциты OKSM 0.02% Eminli et al
Миелоидные предшественники OKSM 25% Eminli et al
HSC OKSM 13% Eminli et al
СК жировой ткани OKSM 0.2% Sugii et al
Дермальная папилла окм 1.4% Tsai et al
Дермальная папилла OK 0.02% Tsai et al
Эндодерма |3-клетки ПЖЖ OKSM 0.1% Stadtfeld et al
Печёночная эндодерма OKS ND Aoi et al
Эктодерма NSC OK <0.1% JB Kim et al
О <0.01% JB Kim et al
Меланоциты окм 0.2% Utikal et al
Человек Мезодерма Фибробласты OKSM 0.02% Takahashi et al
OSLN 0.02% Yu et al
OKS 0.002 Nakagawa et al
Клетки периферической крови OKSM 0.01% Loh et al
Эндотелиальные клетки пуповинной крови OSLN <0.01% Haase et al
СК пуповинной крови OKSM ND Eminli et al
OS <0.01% Giorgetti et al
СК жировой ткани OKSM 0.5% Sugii et al
OKS <0.1% Aoki et al
Энтодерма Г епатоциты OKSM 0.1% HLiuetal
Эктодерма Кератиноциты OKSM ND Aasen etal
OKS ND Aasen et al