Механизм накопления белков в ядрышке

• Автор: Мусинова, Яна Рафаеловна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 131 с. : ил.

Оглавление
Список условных обозначений
Введение
Цель и задачи исследования
Научная новизна
Практическое значение
Обзор литературы
1. Ядрышко
1.1. Структурная организация ядрышка
2. Белки ядрышка
2.1. Фибрилларин какмаркерный белок ПФК
2.2. В23 как маркерный белок ГК
3. Динамика белков ядрышка
4. Инактивация транскрипции рДНК: сегрегация ядрышка
5. НиЬ-белки ядрышка
6. Сигналы ядрышковой локализации (1Мо1_5)
Материалы и методы
Результаты
1. Все известные N01.5 обогащены положительно заряженными аминокислотами
2. Уровень накопления химерных белков в ядрышке зависит от аминокислотного состава искусственных N015
3. Гистон Н2В как модель для анализа сигналов ядрышковой локализации в системе /7? vivo
4. Избыток гистона Н2В накапливается в ядрышке
5. Гистон Н2В-ЕСБР взаимодействует с ядрышком и хроматином посредством различных механизмов
6. Гистон Н2В локализуется в компартментах ядрышка, оккупированных белками гранулярного компонента
7. Картирование активности сигнала ядрышковой локализации в гистоне Н2В
8. Заключение
Выводы
Список цитируемой литературы

Список условных обозначений
Для аминокислот и их производных использовались обозначения, рекомендуемые комиссией по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии (ШРАС)и Международного союза биохимиков (IUP).
В работе использовались также следующие сокращения и обозначения:
ПААТ полиакриламидный гель ПЦР полимеразная цепная реакция ТЕМЕД N, N, N’, N’- тетраметилэтилендиамин ЭДТА этилендиаминтетраацетат
(E)GFP зеленый флуоресцирующий белок (green fluorescent protein) mCherry белковый тэг, флуоресцирующий в красном спектре NLS сигнал ядерной локализации (nuclear localization signal)
NoLS сигнал ядрышковой локализации (nucleolar localization signal)
PMSF фенил-метилсульфонил-фторид (phenylmethanesulfonylfluoride)

Введение
Известно, что нормальное функционирование интерфазного ядра (как и других органоидов эукариотической клетки, ограниченных липидными мембранами) обеспечивается механизмами, контролирующими селективный транспорт молекул между цитозолем и внутренним компартментом. В интерфазных ядрах роль своеобразного «молекулярного сита» выполняет ядерная оболочка, в которую встроены специализированные структурные комплексы - ядерные поры. Именно в ядерных порах локализована система нуклеоплазматического транспорта белков и рибонуклеопротеиновых частиц. Показано, что макромолекулы, импортирующиеся в ядро или экспортирующиеся из ядра в цитозоль, несут специальные сигналы, которые узнаются белками комплексов ядерных пор. В случае импортируемых макромолекул эти сигналы обозначаются как сигналы ядерной локализации (Nuclear Localization Signal, NLS) После вхождения в ядро импортированные белки (например, белки хроматина, факторы транскрипции и процессинга РНК и многие другие) перераспределяются по ядерным субдоменам. В настоящее время в интерфазных ядрах описано несколько структурно-функциональных субдоменов: ядрышки, тела Кахаля (Cajal bodies),
интерхроматиновые гранулы (nuclear speckles), протеасомы, тельца, Polycomb bodies, стрессовые белки (PML bodies) и некоторые другие (Мао et al, 2011).
Поскольку субдомены ядра не имеют ограничивающих мембран, очевидно, что поддержание их устойчивого структурно-функционального состояния требует наличия специальных механизмов, кардинально отличающихся от механизмов, обеспечивающих общий гомеостаз ядра и других мембранных органелл клетки. При этом необходимо учитывать, что большинство ядерных белков (за исключением коровых гистонов и ламинов) являются высоко динамичными, т.е. связаны со своими сайтами не стабильно, а только на протяжении небольшого времени, называемого «временем удержания».

Праймеры разводились водой до объема указанного производителем. Для отжига адаптеров готовили раствор, состоящий из 80 мкл воды, 5 мкл каждого из праймеров и 10 мкл 10х буфера для отжига праймеров. Полученый раствор инкубировали 5мин при 94°С, затем 5 мин при температуре 70°С. Полученные адаптеры хранили при -20°С.
Лигирование
Лигирование производили с использованием Т4-лигазы (Fermentas) в соответсвии с инструкциями производителя.
Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля
Для элюции использовали набор DNA Extraction Kit (Fermentas).
Бактериальные штаммы
Штамм E.coli DH5a.
Микробиологические среды
Для выращивания культуры Е. coli использовали среда LB, содержищую 1% триптона, 0.5% дрожжевого экстракта и 1% NaCl, В твердые микробиологические среды дополнительно добавляли 1.5 % бакто-агара и после стерилизации разливали в чашки Петри по 20 мл.
Приготовление компетентных клеток
Для приготовления компетентных клеток к 3 мл среды LB добавляли 150 мкл ночной культуры клеток и наращивали в течение 1 часа на термостатированной качалке при температуре 37°С. Затем клетки осаждали посредством центрифугирования в течение 1 мин при 5 тыс. об./мин. Супернатант удаляли. К клеткам добавляли 500 мкл 100 мМ СаСЬ и инкубировали 30 мин на льду, после чего центрифугировали 1 мин при