Апоптоз лимфоцитов периферической крови у пациентов с болезнью Паркинсона, ассоциированной с мутациями в генах LRRK2 и GBA

• Автор: Усенко, Татьяна Сергеевна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 129 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Оглавление
Список сокращений
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Патогенез БП
1Л Л Клиническая характеристика и эпидемиология БП
1.1.2 Наследственные формы БП
1.1.2.1 Мутации в гене ЬКБК2
1.1.2.2 Предполагаемые функции ЫЖО
1.1.3 Гены предрасположенности к БП
1.1.3.1 Мутации в гене ОБА
1.1.3.2 Предполагаемые механизмы патогенеза БП, ассоциированной с мутациями в гене ОБА
1.1.4 Молекулярные механизмы патогенеза БП
1.2 Роль программируемой клеточной гибели (апоптоза) в патогенезе БП
1.2.1 Характеристика апоптоза
1.2.2. Основные пути индукции апоптоза
1.2.2.1 Рецепторный путь
1.2.2.2 Митохондриальный путь
1.2.3 Апоптоз как один из возможных механизмов нейродегенерации
при БП
1.3. Лимфоциты периферической крови как объект исследования патогенеза
нейродегенеративных заболеваний
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Характеристика обследованных групп
2.2 Выделение ДНК из периферической крови человека
2.3. Полимеразная цепная реакция и рестрикционный анализ
2.3.1 Идентификация мутации А1226С (N3708) в гене СИЛ
2.3.2 Идентификация мутации Т1448С (Ь444Р) в гене ОБА

2.4 Выделение фракции лимфоцитов периферической крови
2.5 Оценка уровня мРНК генов FAS и BCL
2.6 Культивирование лимфоцитов периферической крови
2.7 Оценка активации каспазы 8 и каспазы
2.8 Статистическая обработка данных
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Частота мутаций A1226G (N370S) и Т1448С (L444P) в гене GBA у пациентов с БП
3.2 Апоптоз лимфоцитов периферической крови
3.2.1 Спонтанный апотоз
3.2.2 Индуцированный апоптоз
3.2.3 Влияние Л-ДОФА терапии на уровень спонтанного апоптоза
3.3 Маркеры апоптоза
3.3.1 Уровень мРНК генов FAS и BCL
3.3.2 Активация каспазы 8 и каспазы
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
Список использованной литературы
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ БП - болезнь Паркинсона сБП - спорадическая БП ЧС - черная субстанция ЦНС - центральная нервная система ПЭТ - позитронно-эмиссионная томография МФТИ - 1-метил-4-фенил-1,2,3,6 - тетрагидропиридин МФП+- 1-метил-4-фенил-пиридин ион НАД+ - никотинамидадениндинуклеотид АТФ - аденозинтрифосфат Л-ДОФА - L - дигидроксифенилаланин ГЩР - полимеразная цепная реакция 1ТААГ - полиакриламидный гель ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ГТФ - гуанозинтрифосфорная кислота мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота LRRK2 - ген обогащённой лейциновыми повторами киназы GBA -ген глюкоцереброзидазы п.о. - пара оснований
o.e. - относительные единицы ПКГ - программируемая клеточная гибель GWAS -полногеномный анализ ассоциаций
Для обеспечения нормального функционирования внутриклеточных систем требуется синтез АТФ в митохондриях; естественная функция митохондрий может нарушаться при мутациях в генах DJ-1, PARK2, PINK1 (Farrer et al., 2006).
Предполагается, что LRRK2 участвует в стабилизации сети микротрубочек в нейроне, что обеспечивает нормальный клиренс медиаторов, хотя субстраты этой киназы остаются неизвестными. Мутации в данном гене, по-видимому, могут приводить к нарушению процессов фосфорилирования (Farrer et al., 2006). Кроме того, существуют данные, свидетельствующие о прямом взаимодействие белка LRRK2 с белком SNCA (Lin et al., 2009). Также LRRK2 взаимодействует с паркиным через ROC домен (Smith et al., 2006). По-видимому, в селективной гибели дофаминергических нейронов вовлечены несколько факторов: альфа-
синуклеин и паркин, которые экспрессируются преимущественно дофаминергических нейронах ЧС, в этих нейронах присутствует дофаминовый транспортер, экспрессирующийся на поверхности нейронов, через который в клетку могут поступать токсичные ионы. Кроме того, дофаминергические нейроны более подвержены окислительному стрессу из-за синтеза дофамина, сопровождающегося повышенным производством супероксидных радикалOB.(Ahmadi et al., 2008; Sherer et al., 2003; Wanget al.,2010).
В последние годы ряд исследований указывает на ведущую роль в патогенезе БП нарушений процесса деградации белков в клетке, в частности лизосомальной деградации белков (аутофагии) (Banerjee, Beal, Thomas, 2010). Блокировка аутофагии у мышей приводит к нейродегенерации (Нага et al., 2006). Известно, что внутриклеточный альфа-синуклеин деградирует двумя путями — путем шаперонзависимой аутофагии и через протеосомный путь деградации белков. При этом посредством шаперон-зависимой аутофагии деградирует более 50% клеточного альфа-синуклеина (Cuervo et al., 2004).
Мутации альфа-синуклеина, выявляемые у пациентов с БП (А53Т, А30Р)