Исследование роли гена орнитинаминотрансферазы в развитии и стрессоустойчивости растений

• Автор: Герасимова, Софья Викторовна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 110 с. : ил.

2.2.11.ПЦ Р
2.2.12. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса
2.2.13. Электрофорез в агарозном геле
2.2.14. Выделение фрагментов из агарозного геля
2.2.15. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.2.16. Лигирование
2.2.17. Трансформация клеток плазмидной ДНК
2.2.18. Селекция клонов на среде, содержащей X-Gal
2.2.19. Определение первичной последовательности ДНК (секвенирование)
2.2.20. Компьютерная обработка данных
2.2.21. Анализ геномной ДНК растений методом ПЦР
2.2.22. Анализ геномной ДНК растений методом Саузерн-блот-гибридизации
2.2.23. Приготовление радиоактивномеченых зондов
2.2.24. Оценка экспрессии ОАТ в тканях трансгенных растений с помощью полуколичественной ПЦР
2.2.25. Определение содержания свободного пролина в тканях растений
2.2.26. Гистохимическое окрашивание
2.2.27. Статистическая обработка данных
3. Результаты
3.1. Исследование фенотипического проявления повышенной и пониженной экспрессии гена ОАТ в трансгенных растениях
3.1.1. Создание генетической конструкции для повышения экспрессии гена ОАТ в трансгенных растениях (pBi-OAT)
3.1.2. Создание генетической конструкции для снижения экспрессии гена ОАТ в
трансгенных растениях (pBi-OATas)
.3.1.3. Получение трансгенных растений N. tabacum
3.1.4. ПЦР-анализ геномной ДНК растений-трансформантов
3.1.5. Саузерн-блот анализ геномной ДНК растений-трансформантов
3.1.6. Оценка уровня транскрипции гена ОАТ в трансгенных растениях
3.1.7. Сегрегационный анализ трансгенных растений в поколении Т1
3.1.8. Оценка числа функционально активных инсерций
3.1.9. Анализ солеустойчивости трансгенных растений
3.1.10. Оценка содержания пролина в листьях трансгенных растений
3.2. Изучение транскрипционной активности промотора гена ОАТ Arabidopsis thaliana
3.2.1. Выделение промоторной области гена ОАТ Arabidopsis thaliana
3.2.2. Создание репортерной генетической конструкции Р1844
3.2.3. Получение и первичный генетический анализ трансгенных растений, несущих репортерную конструкцию
3.2.4. Гистохимический анализ трансформантов. Выявление экспрессии репортерного гена бета-глюкуронидазы (GUS)
3.2.4.1. Гистохимичекий анализ растений (ТО) выращенных в условиях культуры тканей
3.2.4.2. Гистохимический анализ цветущих взрослых растений ТО из теплицы
3.2.4.3. Г истохимический анализ проростков Т1
3.2.5. Компьютерный анализ последовательности промотора гена ОАТ на наличие цис-регуляторных элементов
3.3. Анализ транскрипции гена ОАТ в различных тканях и органах
4. Обсуждение результатов
Заключение
Выводы
Список литературы

Трансформация E. coli проводилась по стандартной методике (Мазин и др., 1990).
Компетентные клетки A. tumefaciens трансформировали следующим образом: к 100 мкл компетентных клеток добавляли плазмидную ДНК, инкубировали 5 минут при температуре 37°С. Добавляли 1,5 мл среды LB, растили при температуре 28°С с перемешиванием 3 часа. Центрифугировали 15 секунд, осадок ресуспендировали в небольшом количестве среды и растирали по чашке Петри с агаризованной средой LB, содержащей соответствующий антибиотик (50 мкг/мл).
2.2.18. Селекция клонов на среде, содержащей X-Gal
Детекция встройки в промежуточный вектор pBluescript проводилась при использовании модифициронного субстрата для бета-галактозидазы — X-Gal. Бактерии, трансформированные вектором pBluescript со встройкой в полилинкере Lac оперона высевались на агаризованную питательную среду, содержащую IPTG и X-Gal, а также антибиотик ампициллин. Белый цвет колоний укзывает на наличие встройки в полилинкер и нарушение целостности Lac-оперона.
2.2.19. Определение первичной последовательности ДНК (секвенирование)
Для каждого клонируемого фрагмента ДНК было проведено секвенирование плазмид 5-6 бактериальных клонов, полученных в результате трансформации лигазной смесью. Секвенирование проводилось в обоих направлениях (с использованием праймеров к каждой цепи ДНК).
Для секвенирования плазмидную ДНК очищали с помощью осаждения полизтиленгликолем (PEG8000). К раствору плазмидной ДНК добавляли NaCl до концентрации 0,8 М, затем равный объем 13% PEG 8000. Осаждали центрифугированием 13000 об./мин 15 минут. Промывали осадок 70% этанолом и растворяли в деионизованной НгО.
Реакцию секвенирования проводили с использованием набора ABI PRISM BigDye Terminator v3.0 согласно инструкции производителя. Расшифровка нуклеотидной последовательности проводилась в Межинститутском центре секвенирования ДНК СО РАН.
Секвенирующую реакцию проводили в 15 мкл реакционной смеси, содержащей 500 нг ДНК-матрицы, 1 мкМ прямого/обратного праймера, 4 мкл BigDye (версии 3.1) в следующих условиях: денатурация 20 секунд при 95°С, отжиг праймеров 20 секунд при 55°С, элонгация 4 минуты при 60°С, число циклов-26.