АТФ - зависимые протеазы и шапероны как эффективные регуляторы экспрессии генов lux-оперона Aliivibrio fischeri

• Автор: Мелькина, Ольга Евгеньевна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 95 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИИ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Цели и задачи

Научная новизна и практическая значимость работы

Структура работы

Апробация работы

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Quorum Sensing системы

1.1. LuxI/LuxR-зависимая регуляция биолюминесценции у морских бактерий A. fischeri

1.2. Ацил-Ь-гомосерин лактоны (AHL) и их взаимодействие с LuxR-подобными белками
1.3. Внутриклеточные факторы регуляции экспрессии генов, входящих в регулоны систем QS
Глава 2. АТФ-зависимые протеазы и шапероны
2.1. Молекулярные шапероны бишаперонной системы DnaKJE-ClpB
2.2. Шаперонины GroEL/GroES
2.3. Участие малых белков-шаперонов и шаперона С1рА в процессах дезагрегации и рефолдинга белков
2.4. АТФ-зависимые протеазы
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 3. Материалы и методы исследования
3.1. Бактериальные штаммы и плазмиды
3.2. Генно-инженерные методы
3.3. Конструирование плазмид
3.4. Выделение и очистка химерных белков
3.5. Измерение экспрессии генов luxlCDABEG A. ßscheri в клетках E. coli
3.6. Термоинактивация и рефолдинг люциферазы

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Глава 4. Исследование влияния ^механизма действия шаперонина. GroEE на фолдинг- белка LuxR и его делегированных форм 4.1. Роль шаперонина GroEL и кошаперонина GroES-в регуляции экспрессии генов /мх-оперона A. fischeri в клетках E. coli 4;2’. Аффинная очистка белка LuxR, его С - и N - доменов Электрофоретическое разделение в полиакриламидном геле белка LuxR, его С - и N - доменов* 4.3. Компенсация gro мутации высокими-концентрациями аутоиндуктора 46' 46- 46 49
Глава1 5; Роль АТФ-зависимых протеаз Lon и GlpXP в регуляции экспрессии генов /шс-опероиа A. fischeri в клетках-K. coli". 5.11 Протеолитический контроль регуляции экспрессии генов lux-оперона A. fischeri в клетках E. coli 5.2. Защитное действие АИ против протеаз Lon и ClpXP 5;3. Исследование влияния и механизма действия протеазы Lon на активность белка LuxR и его делегированных форм 5.4. Сравнение цельного LuxR и его С-домена по эффективности действия в качестве активатора транскрипции /их-оперона A. fischeri 57 57 59 63
Глава 6. Изучение механизма защитного действия бактериальных шаперонов при термоинактивации белков1 в клетке 6.1. Изучение механизма защитного действия бактериальных шаперонов семейства LIsplOO при термоинактивации бактериальной люциферазы А. fischeri в клетках E. coli 6.2. Влияние мутации в гене clpA на индукцию белков «теплового шока» 6.3. Влияние шаперонов IbpAB на DnaK-зависимый рефолдинг бактериальной люциферазы A. fischeri в клетках E. coli 70 71 73
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
QS - Quorum Sensing система,
АТФ - аденозинтрифосфат,
FMN - флавин мононуклеотид,
FMNH2 - восстановленный FMN,
Туг - тирозин,
Тгр - триптофан,
Asp - аспарагин,
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота,
РНК - рибонуклеиновая кислота,
сАМР - циклический аденозинмонофосфат,
CRP - белок-репрессор,
AHL - ацил-Ь-гомосерин лактоны,
АИ - аутоиндуктор,
АИ-1 - аутоиндуктор первого типа (N-3-оксогексаноил-лактон L-гомосерина и его производные),
АИ-11 - аутоиндуктор второго типа,
PQS - 2-гептил-З- гидрокси- 4 - хинолон,
DKP - дикетопиперазин,
SAM - S-аденозилметионина,
ДПД - 4, 5-дигидрокси-2,3-пентандион,
CTD - С-терминальный домен,
NTD - N- терминальный домен,
ИПТГ - изопропил-р-£>-тиогалактопиранозид,
SDS - додецилсульфат натрия,
GST - глутатион трансфераза,
ПЦР - полимеразная цепная реакция,
ПААТ - полиакриламидный гель.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ,
Глава 3. Материалы и.методы
3.1. Бактериальные штаммы, плазмиды и среды
Использованные в работе бактериальные штаммы и плазмиды, а также их генетические характеристики представлены в Таблице 2.
Таблица 2. Бактериальные штаммы и плазмиды.
Характеристика^
SG20250 AlacU169 araDflbB relA clpA+, S.Gottesman (США)
SG22099 clpA::kan (остальные маркеры как у SG20250) -II-
SG22163 malP::laclq -II-
SG22186 А Ion rcsAv.kan (остальные маркеры как у SG22163) -II-
AB 1157 F' thr-1 1еиВ6proA2 his-4 argE3 thi-1 lacYl galK2 ага-14 xyl-5 mtl-l tsx-33 rpsL31 supE44 вкпм
AB 1899 F' Ion А1 (остальные маркеры как у ABI 157) вкпм
NK113 clpPr.cat (остальные маркеры как у AB 1157). N.E.Murray (Англия)
NK114 clpXr.kan (остальные маркеры как у АВ1157) -II-
SKB178 F' galK sup gro+ grdEL91 (остальные маркеры как у SKB178) groEL140 (остальные маркеры как у SKB178) groEL613 (остальные маркеры как у SKB178) ИМГ РАН
OFB1111 groEL613 Glyl73 Asp337 (остальные маркеры как у SKB178) -II-
TG-1 thi-1 supE44 hsdA5 A(lac-proAB) [F' traD36proAB+ lacf lacZAM15] вкпм
MG 1655 F" ilvG reb-50 rph-1 вкпм
BW25113 rmB3AlacX4787 hadR5114 A(araBAD)567 A(rhaBAD)568 rph-1 С.В. Машко (Keio-collection)
JW3664 ibpAr.kan (остальные маркеры как у BW25113) -II-
JW3663 ibpBr.kan (остальные маркеры как у BW25113) -II-
JW0013 dnaK::kan (остальные маркеры как у BW25113) -II-
Плазмиды
pFl вектор pBR322 со встроенным по ВашШ-сайту полным /mr-опероном A. fischeri (luxRluxbCDABE); Apr -II-