Разработка биотехнологии β-маннаназы на основе рекомбинантного штамма B.Subtilis 168

• Автор: Анохина, Екатерина Петровна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 143 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Маннаны растительного сырья и их характеристика
1.2. Р-Маннаназы: продуценты, условия биосинтеза
1.2.1. Продуценты р-маннаназ
1.2.2. Факторы, влияющие на биосинтез маннаназ при культивировании продуцентов
1.3. Генно-инженерные методы в получении высокоактивных продуцентов
1.3.1. Общая характеристика метода рекомбинантных ДНК
1.3.2. Клонирование и экспрессия маннаназных генов
1.4. Получение препаратов Р-маннаназы и их характеристика
1.4.1. Выделение и очистка Р-маннаназ
1.4.2. Физико-химические свойства Р-маннаназ различного происхождения
1.4.3. Продукты деструкции маннанов
1.4.3.1. Функциональные свойства маннозы
и манноолигосахаридов
1.5. Практическое, применение р-маннаназ
Заключение
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объект исследования и условия его культивирования
2.2. Штаммы микроорганизмов, плазмиды и синтетические олигонуклеотиды, используемые в работе
2.3. Методы молекулярного клонирования в бактериях
2.3.1. Выделение хромосомной ДНК
2.3.2. Выделение плазмиды рВІиеЗсгірс кя (+) из грамотрицательных
микроорганизмов - E
2.3.3. Выделение плазмиды рСВ20 из грамположительных микроорганизмов - В. subtilis
2.3.4. Полимеразная цепная реакция
2.3.5. Создание генетических конструкций
«клонирующий вектор - встроенная ДНК»
2.3.6. Трансформация клеток химическим методом
2.3.7. Электрофорез в агарозном геле
2.3.8. Выделение ДНК из агарозного геля
2.4. Определение активности ферментного препарата
2.4.1. Определение активности ß-маннаназы
2.4.2. Методы определения активности сопутствующих
ферментов
2.5. Получение спиртоосажденного фермента
2.6. Определение физико-химических свойств фермента
2.7. Определение степени гидролиза маннанов
2.8. Определение качественного состава продуктов гидролиза
2.9. Исследование пребиотических свойств маннозосодержащих гидролизатов
2.10. Общие биохимические и микробиологические методы исследования
2.11. Статистическая обработка экспериментальных данных
ГЛАВА 3. КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО
ШТАММА - ПРОДУЦЕНТА ß-МАННАНАЗЫ
3.1. Выбор объекта клонирования и системы экспрессии
3.2. Создание генетических конструкций на основе плазмидного вектора pBlueScript ks (+)
3.3. Создание генетических конструкций на основе вектора рСВ20
3.4. Выбор наиболее эффективного промотора для экспрессии гена
(3-маннаназы
3.5. Исследование стабильности рекомбинантного плазмидного
штамма В.subtilis
ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ р-МАННАНАЗЫ И ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ФЕРМЕНТА
4.1. Подбор оптимальных условий глубинного культивирования рекомбинантного штамма В.subtilis
4.2. Получение спиртоосажденного ферментного препарата Р-маннаназы
4.3. Технология получения ферментного препарата рекомбинантной Р-маннаназы В.subtilis
4.4. Исследование влияния pH и температуры на активность Р-маннаназы
4.5. Исследование кинетики кислотной и термической
инактивации р-маннаназы
ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ФЕРМЕНТАТИВНОЙ ДЕСТРУКЦИИ МАННАНОВ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРЕБИОТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
МАННОЗОСОДЕРЖАЩИХ ГИДРОЛИЗАТОВ
5.1. Исследование процесса ферментной деструкции маннанов растительного сырья и идентификация продуктов гидролиза
5.2. Изучение пребиотических свойств маннозосодержащих гидролизатов
5.3. Расчет себестоимости Р-маннаназы по предлагаемой технологии
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
ПРИЛОЖЕНИЯ

Bacillus stearothermophilus проявляла термостабильность, сохраняя полную активность после инкубации в течение 24 часов при 70°С и pH 6.5 [147].
(З-Маннаназа из Pénicillium purpurogenum сохраняла начальную активность при 37 °С в течение 24 часов, но инкубация фермента при 56 °С за 5 минут приводила к полной потере активности [129].
Активность (3-маннаназ, по данным различных авторов, варьирует в широких пределах даже среди организмов одного вида. Так, для разных штаммов В. subtilis она составляла 330 [145] и 961 [51] единиц активности.
Изучению влияния ионов металлов на активность [3-маннаназы посвящены работы многих авторов [67, 115, 126, 129].
При исследовании влияния различных эффекторов на активность (3-маннаназы было показано, что этот фермент, наряду с другими карбогидразами, ингибируется ионами металлов.

Почти все изученные (3-маннаназы ингибируются ионами Fe , Al3+,Hg2+, Cu2+, ЭДТА. Эндоманнаназы ингибируются также и другими ионами, такими как Ag+, Zn2+, Sn2+, Pb2' [139, 155, 158].
Ионы металлов могут активировать микробные (3-маннаназы. Так, (3-маннаназа из Bacillus licheniformis активировалась ионами Mg2+, Са2+, Fe2+, Ni2+ [158].
Интересно, что некоторые ионы металлов, например, Zn2 и Со2+ могут оказывать как ингибирующее действие [114], так и выполнять роль активатора [71] при воздействии на фермент различных продуцентов. Предполагается, что ионы металлов связываются с каталитическими группами активного центра фермента [17].
Скорость и степень гидролиза одного и того же субстрата ферментами из различных продуцентов заметно отличается. Важной