Разработка системы технологических решений для конструирования рекомбинантных белковых антигенов

• Автор: Лунин, Владимир Глебович
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 49 с. : 7 ил.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Получение дешевых, высокоочищенных и стабильных препаратов биологически активных белков, важных для медицинской и сельскохозяйственной практики, является одной из основных задач биотехнологии. Для эффективного решения этой задачи в. качестве продуцентов целевых белков чаще всего используют лабораторные штаммы Escherichia coli. Применение генно-инженерных методов в сочетании с микробиологическим синтезом позволило получить целый ряд биологически активных препаратов: гормоны, интерфероны, цитокины, ферменты и т.д. Однако для многих белков-антигенов, вакцинно—ценных белков, белков различной природы, имеющих большую молекулярную массу, используемые на ранних этапах подходы генной инженерии оказались неэффективны. С их помощью не удавалось освободиться от примесей токсичных липополисахаридов, хозяйской ДНК и решить проблему рефолдинга или восстановления нативной структуры синтезируемого бактериями белка. Эти проблемы были частично решены путем использования эукариотических систем наработки рекомбинантных белков. Однако в реальной практике белковые продукты, получаемые в культурах эукариотических клеток, обладали высокой стоимостью за счет дороговизны питательных сред, сложности оборудования для- культивирования клеток эукариот, высоких требований к стерильности, медленного роста культур и т.д. Таким образом, разработка новых технологических решений и подходов, позволяющих получать различные рекомбинантные белки, является актуальной задачей современной биотехнологии.
Целью данной работы являлась разработка системы новых технологических решений для создания универсальной технологии получения рекомбинантных белковых антигенов и других белков, имеющих практическое значение для медицины и сельскохозяйственной биотехнологии, с помощью методов генной инженерии и микробиологического синтеза. Использование данных разработок должно приводить к повышению эффективности создаваемых бактериальных продуцентов, упрощению технологических подходов, снижению себестоимости и повышению качества получаемых белковых препаратов. Целью работы было также получение на основе разработанных решений новых биотехнологических продуктов, обладающих уникальными свойствами: стимуляторов роста сельскохозяйственных животных, систем доставки лекарственных препаратов, антигенов, кандидатных вакцин.

Для выполнения работы были поставлены следующие ЗАДАЧИ:

1. Разработка системы технологических решений для создания универсальной технологии получения рекомбинантных биологически активных белков, приводящей к повышению эффективности создаваемых бактериальных продуцентов, упрощению технологических подходов, снижению себестоимости и повышению качества получаемых белковых препаратов.
2. На основе разработанной системы технологических решений создание препаратов рекомбинантных двух- и мультидоменных биологически активных белков, антигенов, ферментов, в том числе, иммобилизованных на различных сорбентах за счет аффинного домена, с целью разработки проточных биореакторов, диагностикумов, кандидатных вакцин, стимуляторов роста сельскохозяйственных животных и других
биотехнологических продуктов для применения в сельскохозяйственной и медицинской практике.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Научно-обоснованная система технологических решений, направленная на создание универсальной технологии получения
рекомбинантных белковых антигенов и других белков, имеющих практическое значение для медицины и сельскохозяйственной
биотехнологии, приводящая к повышению эффективности создаваемых
бактериальных продуцентов, упрощению технологических подходов, снижению себестоимости и повышению качества получаемых белковых препаратов.
2. Разработка мультидоменных белковых нанотранспортеров, обеспечивающих специфичную доставку лекарственных средств в клетки-мишени, интернализацию в них, выход из внутриклеточных везикул и доставку в ядро.
3. Разработка препарата-стимулятора роста с/х животных IV поколения «САТ-Сои», основанного на использовании двухдоменного гибридного белка, включающего соматостатин и белок-носитель для иммунокоррекции.
4. Нанобиотехнологический подход, основанный на получении гибридных белков, состоящих из домена целевого белка и аффинного домена, позволяющий повысить устойчивость целевого продукта к протеазам, существенно увеличить выход целевого белка, осуществлять самопроизвольное специфическое связывание с матрицей, высокоэффективную очистку, концентрирование, иммобилизацию и рефолдинг целевого белка на поверхности сорбента.

диссертации, а также руководству институтов и лабораторий, предоставивших возможность для проведения исследований.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в научных рецензируемых журналах;
1. Калинин В.Н., Лапаева И.А., Лунин В.Г.. Скрипкин Е.А., Смирнов В.Д. Выделение эндонуклеазы рестрикции с HindIII—специфичностью из Bordetella bronchiseptica II Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1986. -№4.-С. 16-19.
2. Карягина А.С., Лунин В.Г.. Никольская И.И., Дебов С.С. Функциональная характеристика плазмид штамма S. sonnei 47 // Молекулярная генетика. - 1986. - № 10. - С. 16-21.
3. Grabko V.I., Lunin V.G.. Naroditsky В.S., Khilko S.N., Tickhonenko T.I., Makhov A.M., Karpova O.V. Study of avian adenovirus DNA infectivity in chick embryos // Acta Virol. - 1987. - Vol. 31. - P. 97-102.
4. Карягина A.C., Лунин В: Г.. Грубер И.И., Поляченко В.М., Никольская И.И., Дебов С.С. Активность рестрикционной эндонуклеазы SsoU в штаммах Escherichia coli, трансформированных плазмидами Shigella sonnei 47 // Молекулярная генетика. - 1987. -№ 12. - С. 26-29.
5. Rivkina М.В., Lunin V.G.. Mahov A.M., Tikchonenko T.I., Kukain R.A. Nucleotide sequence of integrated.hepatitis В virus DNA and human flanking regions in the genome of the PLC/PRF/5 cell line // Gene. - 1988. - Vol. 64. - P. 285-296.
6. Карпов B.A., Лунин В.Г.. ТихоненкоТ.И. Фазированный полилинкер для-клонирования и экспрессии генов // Молекулярная генетика, микробиология* и вирусология. - 1989. - № 9. - С. 28-33.
7. Сергиенко О.В., Лунин В'.Г.. Тихоненко Т.Н. Полимеризация фрагментов ДНК, кодирующих эпитопы поверхностных антигенов вируса гепатита В, в клетках Escherichia coli II Молекулярная генетика, микробиология'и вирусология. - 1989-№10.-С. 24-29.
8. Сергиенко О.В., Лунин В.Г.. Смирнов В.Д., Тихоненко Т.Н. Синтез и. экспрессия фрагментов ДНК, кодирующих эпитопы поверхностных антигенов, вируса гепатита В, клетками Escherichia coli // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1989. - № 9. - С. 39-42.
9. Karyagina A.S., Lunin V.G.. Nikolskaya I.I. Characterization of the genetic determinants of SsoII-restriction endonuclease and modification methyltransferase // Gene.- 1990.-Vol. 87.-P. 113-118.
10. Akopian T.A., Lunin V.G.. Kruglyak V.A., Ruchadze G.G., Bakhutashvili V.I., Naroditsky B.S., Tichonenko T.I. Nucleotide sequence of the cDNA. for porcine rotavirus VP7 gene (strain K) // Virus Genes. - 1992. - Vol. 6. - P. 393-396.
11. Karyagina A.S., Lunin V.G.. Degtyarenko K.N., Uvarov V.Y., Nikolskaya I.I. Analysis of the nucleotide and derived amino acid sequences of the Ssol restriction endonuclease and methyltransferase // Gene. - 1993. -Vol. 124. - P. 13-19.
12. Карпова C.K., Сазина E.T., Бадер Л.Б., Сергиенко О.В., Ходун М.Л., Кривцов В.Ф., Лунин В.Г.. Тихоненко Т.Н., Панков Ю.А. Генетическая инженерия в бактериальном синтезе соматостатина // Вестник Российской Академии Медицинских Наук. - 1994. - № 12. - С. 24-29: