Создание эффективного процесса биотрансформации L-изолейцина в 4-гидроксиизолейцин методами метаболической инженерии Escherichia coli

• Автор: Киверо, Александр Дмитриевич
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 109 с. : ил.

Оглавление
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
1. ВВЕДЕНИЕ
1.1. Актуальность проблемы
1.4. Цели и задачи работы
1.3. Научная новизна и практическая значимость работы
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Введение
2.2. Сахарный диабет II типа как эволюционный вызов современной цивилизации
2.3. Молекулярно-биологические основы инсулиновой регуляции гомеостаза глюкозы
2.3.1. ИНЗСД и гомеостаз глюкозы
2.3.2. Инсулин и его секреция ß-клетками
2.3.3. Инсулиновая регуляция гомеостаза глюкозы
2.4. Немедикаментозная терапия и профилактика ИНЗСД
2.4.1. Физические упражнения
2.5. Современная медикаментозная терапия и профилактика ИНЗСД: препараты, корректирующие инсулиновую регуляцию метаболизма глюкозы
2.5.1. Секретагоги инсулина
2.5.2 Ингибиторы синтеза глюкозы в печени
2.5.3. Сенсибилизаторы инсулинового действия и инсулиномиметики
2.6. 4-гидроксиизолейцин как современное средство лечения и профилактики ИНЗСД
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Бактериальные штаммы и плазмиды
3.2. Среды, условия культивирования штаммов и проведения ферментативных реакций
3.3. Определение относительных метаболических потоков углерода
3.4. Генно-инженерные методики
3.5. Конструирование штаммов и плазмид
3.6. Очистка 1DO и его идентификация методом “finger printing”
3.7. Анализ результатов ферментативных реакций и ферментационного культивирования
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Выбор оптимальной стратегии промышленного синтеза 4-HIL: история вопроса
4.2. Идентификация гена ido из Bacillus thuringiensis (2-е-2)

4.2.1. Выбор стратегии
4.2.2. Оптимизация культивирования Bacillus thuringiensis 2-е-2 с целью получения биомассы с максимальной удельной активности IDO
4.2.3. Очистка IDO из грубого клеточного лизата Bacillus thuringiensis 2-е
4.3. Клонирование гена ido и его экспрессия в клетках E
4.4. Разработка "динамической" биотрансформации L-изолейцина B4-HIL: сопряжение клеточного роста и гидроксилирования L-изолейцина в штамме 2А
4.5. Повышение экономичности процесса биотрансформации: перераспределение углеродного потока от синтеза биомассы к реакции гидроксилирования L-изолейцина
5. ВЫВОДЫ
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
4-HIL - (2S, 3R, 48)-4-гидроксиизолейцин
сАМР (цАМФ) - циклоаденозинмонофосфат (аденозин-3 ’ ,5 ’ - циклофосфат) DTT - дитиотреитол (трео-2,3-дигидрокси-1,4-димеркаптобутан)
E.coli - Escherichia coli
GLP-1 - глюкагон-подобного пептида
GLUT2-4 - транспортеры глюкозы
HEPES - N-2-Гидроксиэтилпиперазин-Ы’-2-этансульфоновая кислота IDO - Ь-изолейцин-4-гидроксилаза (диоксигеназа)
IPTG (ИПТГ) - изопропил - (З-Б-тиогалактопиранозид
IRS-1 - субстрат инсулинового рецептора
RBS — участок связывания рибосом
SDS - додецилсульфат натрия
АТФ - аденозин 5’- трифосфат
ИНЗСД - инсулиннезависимый диабет II типа
ОВПФП - окислительная ветвь пентозофосфатного пути катаболизма глюкозы
ПААГ - полиакриламидный гель
ПСМ - производные сульфонилмочевины
ПФП - пентозофосфатный путь катаболизма глюкозы
ПНР - полимеразная цепная реакция
X-gal - 5-бромо-4-хлоро-3-индоил-бета-Б-галактопиранозид ЦТК - цикл трикарбоновых кислот(цикл Кребса)
ЭДП - 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатный путь катаболизма глюкозы (путь Энтнера-Дудорова)
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

цитоплазмы в мембрану. Однако эффект обратим и быстро дезавуируется сразу после прекращения тренировки [65]. Было выяснено, что в запуске
соответствующих сигнальных каскадов принимают участие АМФ, образующийся

в результате гидролиза АТФ во время сокращения мышц, и Ca“ , высвобождающийся из саркоплазматического ретикулума при деполяризации мембраны. АМФ активирует АМРК-киназу в то время как Са2 участвует в активации некоторых изоформ РКС-киназы [66].
В опытах с животными было показано, что физические упражнения повышают эффективность отдельных стадий инсулинового сигнального каскада, включая быстрое фосфорилирование рецептора инсулина (IR), субстратов инсулинового рецептора-1 и -2 (IRS-1 и IRS-2) и активацию фосфатидилинозитол-3-киназы (Р13-киназы) [67]].
2.4.2. Диетическое питание
Хорошо известно, что содержание макроэлементов и состава диеты оказывают сильное влияние на транспорт глюкозы в клетках мышечной и жировой ткани посредством тканеспецифического изменения экспрессии генов транспортеров SLC2A1, SLC2A4, и функциональной активности транспортеров GLUT1 и GLUT4 [68]. Например в адипоцитах крыс с разным диетическим питанием наблюдались существенные изменения в экспрессии гена SLC2A4, в то время как в клетках скелетных мышц были выявлены изменения в функциональной активности GLUT4 [69].
Как известно, диеты с высоким содержанием жира приводят к инсулинорезистентности [68]. Так, в жировых клетках из тучных крыс (ожирение было вызвано или высококалорийным питанием или диетой с большим содержанием жиров), снижение стимулированного инсулином транспорта глюкозы наблюдалось только в адипоцитах животных содержавшихся на жировой диете и было связаны с изменением экспрессии SLC2A1 и SLC2A4 и снижением уровней GLUT4 (на 90%) и GLUT1 (на 62%) [70]. Жирная пища снижает