Антимикробные пептиды сорного растения Stellaria media и их гены : экспрессия и устойчивость к фитопатогенным грибам

• Автор: Шукуров, Рахим Рахманкулыевич
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 126 с. : ил.

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Антимикробные пептиды и PR-защитные белки

1.2. Основные группы антимикробных пептидов

1.3. Дефензины

1.3.1. Структура и распределение

1.3.2. Молекулярно-биологические особенности строения дефензинов

1.3.3. Особенности экспрессии дефензинов

1.3.4. Индукция экспрессии дефензинов в растениях

1.3.5. Биологическая активность дефензинов
1.3.6. Антигрибная активность
1.3.7. Способы действия антигрибных дефензинов
1.4. Тионины
1.5. Липид-переносящие белки
1.6. Циклотиды
1.7. Снакины
1.8. Четырех-цистеиновые антимикробные пептиды
1.8.1. Пептиды Impatiens balsamina
1.9. Ноттины
1.10. Гевеин и гевеин-подобные пептиды
1.11. Заключение
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Биологический материал
2.2. Выделение РНК и синтез первой цепи кДНК
2.3. Выделение геномной ДНК из тканей растений
2.4. Определение концентрации нуклеиновых кислот
2.5. Полимеразная цепная реакция и электрофорез фрагментов ДНК
2.6. Приготовление компетентных клеток
2.7. Клонирование ПЦР-продуктов методом TA-cloning
2.8. Измерение экспрессии генов pro-SmAMPl-З в растениях мокрицы
2.8.1. Получение растительного материала
2.8.2. ОТ-ПЦР в реальном времени
2.8.3. Определение тканеспецифичности экспрессии генов pro-SmAMPl-З
2.9. Создание векторов для трансформации растений
2.10. Трансформация растений табака и арабидопсиса

2.10.1. Получение трансгенных растений Arabidopsis thaliana
2.10.2. Молекулярный анализ трансгенных растений арабидопсиса
2.10.3. Получение трансгенных растений табака
2.10.4. Молекулярный анализ трансгенных растений табака
2.11. Биологический анализ трансгенных растений
2.11.1. Анализ устойчивости отдельных трансгенных растений арабидопсиса к грибу Bipolaris sorokiniana
2.11.2. Анализ устойчивости линий трансгенных растений табака к фитопатогенному грибу Thielaviopsis basicola
2.11.3. Оценка выживаемости трансгенных растений, выращенных на инфекционном фоне с фитопатогенными грибами
2.12. Получение трансгенных растений Arabidopsis thaliana, экспрессирующие гены антимикробных пептидов из растения мокрицы с усилением их трансляции энхансерами из Y вируса картофеля
2.12.1. Приготовление конструкций
2.12.2. Трансформация и молекулярно - биологический анализ Arabidopsis thaliana
2.13. Получение поликлональных антител к pro-SmAMPl
2.14. Вестерн-блоттинг
2.15. Промотор генаpro-SmAMP
2.15.1. Установление и анализ нуклеотидной последовательности промотора гена рго-SmAMP
2.15.2. Приготовление генетических конструкций с репортерным геном GUS для делеционного анализа промотора и трансформация растений
2.15.3. Измерение активности глюкоронидазы (GUS)
2.15.4. Обработка метилжасмонатом и фитопатогенным грибом Thielaviopsis basicola для определения активации промотораpro-SmAMP
2.16. Статистика
РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Экспрессия геновpro-SmAMP
3.2. Повышение устойчивости трансгенных растений Arabidopsis thaliana и Nicotiana tabacum, экспрессирующих pro-SmAMP
3.2.1. Arabidopsis thaliana
3.2.2. Nicotiana tabacum
3.3. Arabidopsis thaliana, экспрессирующие гены антимикробных пептидов из Stellaria media с добавленными энхансерами трансляции из Y вируса картофеля
3.4. Вестерн-анализ
3.4.1. Исследование процессинга пропептида pro-SmAMP 1 в растениях мокрицы
3.4.2. Исследование процессинга пропептида pro-SmAMP 1 в трансгенных растениях арабидопсиса pro-SmAMP
3.5. Промотор гена pro-SmAMP

3.5.1. Идентификация нуклеотидной последовательности промотора генарго-SmAMP2 и ее анализ
3.5.2. Делеционный анализ промотораpro-SmAMP
3.5.3. Изучение особенности экспрессии промотораpro-SmAMP2 в различных органах растений
3.5.4. Изучение активации промотораpro-SmAMP2 метилжасмонатом и фитопатогенными грибами
ОБСУЖДЕНИЕ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

более распространенны в растительном царстве, чем было принято ранее (Craik, 2009). Интересно отметить, что их исключительно высокая стабильность привела к их использованию в качестве так называемого «шаблона» для белок - содержащих лекарств в фармацевтической промышленности (Craik, 2009; Gruber et al., 2008).
1.7. Снакипы.
Снакины это цистеин-богатые пептиды, представленные в разных видах растений с широким спектром антимикробной активности in vitro. Два хорошо описанных пептида представляют этот класс: Снакин-1 (StSNl) (Segura et al., 1999) и Снакин-2 (StSN2) (Berrocal-Lobo et al., 2002), оба выделенные из клубней картофеля (S. tuberosum cv. Jaerla). Они проявляют широкий спектр антимикробных активностей - отличающие их от дефензинов, выделенных из этих же тканей - против специфических бактериальных (Ralstonia solanacearum и Erwinia chrysanthemï) и грибных патогенов (Botritys cinerea).
Более распространенный Снакин-1, пептид из 63-аминокислотных остатков в длину с 12 цистеинами, в то время как Снакин-2 это паралог StSNl (также содержащий 12 цистеиновых остатка) с низким сходством аминокислотной последовательности (38%). Экспрессия снакинов активируется при повреждении и грибном инфицировании и снижается при бактериальном инфицировании. Ортологи снакинов были детектированы в других растениях, включая томаты (Solanum lycopersicum) (Shi et al., 1992), A. thaliana (Herzog et al., 1995) , Gerbera x hybrida Hort. (Kotilainen et al., 1999) , Fragraria x annanasa Duch., Ricinus communis и Petunia x hybrid (Ben-Nissan and Weiss, 1996). Эксперименты показывают, что в отличии от StSNl, который не отвечает на гиббереллин (Berrocal-Lobo et al., 2002), экспрессия StSN2 активируется гиббереллином и подавляется абсцизовой кислотой (Berrocal-Lobo et al., 2002).
1.8. Четырех-цчстеиновые антимикробные пептиды.
Сообщалось, по крайней мере, о двух семействах антимикробных пептидов с четырьмя цистеинами: МВР-1, 33-членный пептид из кукурузы (Duvick et al., 1992), и группа 20-членных пептидов (Ib-AMPs) (Patel et al., 1998; Tailor et al., 1997), выделенных из семян Impatiens balsamina. Первый пептид активен как против грибов, так и против грамположительных и грамотрицательных бактерий (Duvick et al., 1992), в то время как Ib-AMPs ингибируют грибы и только грамположительные бактерии (Tailor et al., 1997).