Митохондриальная регуляция экспрессии белков теплового шока у растений и дрожжей

• Автор: Федосеева, Ирина Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Иркутск
• Количество страниц: 192 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Механизмы термотолерантности
2.2. Классификация БТШ
2.3. Регуляция синтеза БТШ
2.4. Механизмы регуляции экспрессии генов БТШ
2.5. Митохондрии, как регулятор процессов, отличных от процесса производства энергии
2.6. Дрожжи как модельный объект
2.7. Выводы из обзора литературы и формулирование цели исследования и задач
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Объекты исследования
3.2. Использованные концентрации ингибиторов и разобщителей ЭТЦ
3.3. Температурные обработки и обработка ингибиторами и разобщителями ЭТЦ
3.4. Определение жизнеспособности
3.5. Определение дыхательной активности
3.6. Определение каталазной активности
3.7. Выделение суммарного белка
3.8. Электрофорез в ПААГе с ДДС-Na
3.9. Окрашивание и обесцвечивание гелей
3.10. Вестерн-блоттинг
3.11. Использованные антитела
3.12. ОТ-ПЦР-анализ
3.12.1. Выделение РНК
3.12.2. Денатурирующий РНК электрофорез
3.12.3. Синтез кДНК
3.13. Флуоресцентная микроскопия
3.14. Люминесценция экворина
3.15. Статистическая обработка данных
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Дисфункция митохондрий и защитная реакция на тепловой стресс в клетках суспензионной культуры A. thaliana
4.1.1. Изучение влияния ингибиторов ЭТЦ на экспрессию БТШ в клетках суспензионной культуры A. thaliana
4.1.2. Изучение влияния ингибиторов ЭТЦ на развитие индуцированной термотолерантности в клетках суспензионной культуры A. thaliana
4.1.3. Специфичность действия ингибиторов ЭТЦ на развитие индуцированной термотолерантности в клетках суспензионной культуры A. thaliana
4.1.3. Изучение эффекта мягкого теплового стресса на дыхательную активность и гиперполяризацию внутренней митохондриальной мембраны в клетках
суспензионной культуры A. thaliana
4.2. Дисфункция митохондрий и защитная реакция на тепловой стресс в клетках дрожжей 5. cerevisiae

4.2.1. Изучение влияния ингибиторов ЭТЦ на гиперполяризацию внутренней митохондриальной мембраны и экспрессию генов БТШ в клетках дрожжей Б.
сегеу1л1ае в зависимости от типа энергетического метаболизма
4.3. Изучение зависимости между изменением концентрации внутриклеточного кальция и гиперполяризацией внутренней митохондриальной мембраны при мягком тепловом стрессе у дрожжей 5. сегегшяе
4.3.1. Изучение влияния мутаций в генах ССН1 и МЮ1 на параметры роста и особенности функционирования митохондрий в клетках дрожжей Б. сеге1в1ае
4.3.1.1. Параметры роста дрожжей на твердой среде
4.3.1.2. Параметры роста дрожжей на жидкой среде
4.3.1.3. Измерение интенсивности поглощения кислорода
4.3.1.4. Базовая термотолерантность
4.3.2. Изучение влияния мутаций в генах ССН1 и МЮ1 на развитие индуцированной термотолерантности и синтез Нзр104 в клетках дрожжей Б. сегеу1в(ае
4.3.3. Изучение влияния мутаций в генах ССН1 и МЮ1 на способность азида натрия ингибировать индуцированную термотолерантность и синтез Няр 104 в клетках дрожжей Б. сегеп$1ае
4.3.4. Влияние мягкого теплового стресса на уровень кальция в цитозоле клеток дрожжей Б. сегеу1в1ае
4.3.5. Изучение влияние азида натрия на изменение уровня внутриклеточного кальция при мягком тепловом стрессе в клетках дрожжей Б. сегем1х1ае
4.3.6. Изучение влияния мутаций в генах ССН1 и МЮ1 на изменение потенциала на внутренней митохондриальной мембране и дыхательную активность в клетках
дрожжей Б. сегеу1з1ае
4.4. Эффект экзогенного кальция на ответ дрожжей 5. сегетшое на повышение температуры
4.4.1. Обработка экзогенным кальцием повышает термотолерантность и синтез БТШ в клетках дрожжей Б. сегеу1в1ае
4.4.2. Влияние экзогенного кальция на термотолерантность в зависимости от присутствия белков СсМр М1й1р
4.4.3. Специфичность действия ионов кальция на термотолерантность и синтез Нзр104 в клетках дрожжей Б. сегех1л1ае
4.4.4. Повышение термотолерантности и индукция синтеза Нлр104 подавляется азидом натрия в клетках дрожжей Б. сегепл1ае
4.4.5. Изучение влияния ионов кальция на индуцированную термотолерантность и синтез Н$р104 в клетках дрожжей Б. сегех1в1ае
4.4.6. Изучение влияния ионов кальция на синтез Нхр104 в клетках мутанта
тзп2Лтзп4А
5. ОБСУЖДЕНИЕ
5.1. Митохондрии играют ключевую роль в развитии ответа на тепловой стресс у культуры клеток И. ФаИапа и дрожжей У сегегшае
5.2. Тепловой стресс вызывает повышение потенциала на внутренней митохондриальной мембране в клетках культуры клеток А. ФаИапа и дрожжей У сегегшяе
5.3. Мягкий тепловой стресс вызывает повышение концентрации цитозольного кальция в клетках дрожжей У сегегшяе

5.4. Обработка экзогенным кальцием индуцирует синтез HSP104 и повышение термотолерантности в клетках дрожжей S. cerevisiae
6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
7. ВЫВОДЫ
7. СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

если у температуро чувствительного мутанта по V-АТФазе vma2A при 28 °С базовый уровень цитозольного кальция был в пределах 80-85 нМ, то при 37 °С он повышался до 110-120 нМ по сравнению с клетками дикого типа (Forster, Капе,
2000).
Показано влияние Са2+ на ДНК-связывающую активность Hsf у животных и растений (Price, Calderwood. 1991; Li et al., 2004; Медведев, 2005). Вероятно, этот феномен обусловливается способностью Са2+/кальмодулин зависимой протеинкиназы человека фосфорилировать остаток серина в положении 230 (Holmberg et al., 2001). Другие исследователи показали возможную роль инозитол 1,4,5-трифосфата (1Р3) в увеличении концентрации цитоплазматического кальция и в дальнейшей передаче сигнала при мягком тепловом стрессе (37 °С) (Liu et al., 2006). Показано также участие фосфатазы /1?Рр7, активность которой была индуцирована тепловым стрессом, в развитии термотолерантности. Этот белок взаимодействует как с кальмодулином, так и с Hsf и необходим для индукции Hsp70 и HsplOl (Liu et al., 2007).
Известно, что экзогенный кальций может индуцировать синтез БТШ у растений и животных. Так, экзогенный кальций повышал активность гена ß-глюкуронидазы (GUS), который экспрессировался под промотором AtHSP18.2, и девяти изоформ кальмодулина (Са2+/кальмодулин), одной из которых - ИгСаМЗ приписывают роль ключевого компонента Са2+/кальмодулин зависимого сигналинга при тепловом стрессе (Liu et al., 2005; Zhang et al., 2009). Эффект кальция был специфичен, магний такого эффекта не вызывал (Liu et al., 2005). Обработка экзогенным СаС12 повышала устойчивость проростков табака к тепловому шоку (Gong et al., 1998), а также увеличивала экспрессию генов HSP26 и HSP70 у пшеницы, а блокаторы кальциевых каналов (верапамил и LaCl3), а также EGTA ингибировали эту экспрессию (Liu et al., 2003).
Обработка экзогенным кальцием повышает устойчивость клеток дрожжей к действию ряда стрессовых воздействий. Добавление внеклеточного кальция ослабляло ингибирующий эффект активатора кальциевых каналов, амиодарона, на рост дрожжей. Такого эффекта не наблюдалось у мутантов по генам MIDI и CCHI, кодирующих кальциевые каналы (Courchesne, Ozturk 2003). Также внеклеточный кальций повышал жизнеспособность дрожжей при обработке половым феромоном