Роль серин-треониновых протеинкиназ в регуляции ответа на тепловой стресс цианобактерии Synechocystis sp. PСС 6803

• Автор: Зорина, Анна Алексеевна
• Шифр специальности: 03.01.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 115 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ЦЕЛЬ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Цианобактерии как модельный объект

Серин-треониновые протеинкиназы цианобактерий

Структура серин-треониновых протеинкиназ

Классификация СТПК цианобактерий

Расположение СТПК в сигнальном каскаде

Регуляция активности протеинкиназ

Исследование функций СТПК

Современные методы исследования протеома
Системы восприятия и передачи высокотемпературного стрессового сигнала
Ответ на тепловой стресс
Шаперонные системы Synechocystis
Роль фосфорилирования в регуляции активности шаперонных систем
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Штаммы, использованные в работе, и условия культивирования
2.2. Конструирование мутантных штаммов Synechocystis дефектных по генам СТПК и hrcA
2.3. Штаммы E. coli, использованные в работе
2.4. Трансформация клеток цианобактерий
2.5. Условия культивирования
2.6. Измерение параметров роста
2.7. Исследование ультраструктуры клеток Synechocystis методом электронной микроскопии
2.8. Выделение общей клеточной РНК
2.9. Нозерн-блот гибридизация
2.10. Выделение фракции растворимых белков

2.11. Фосфорилирование белков in vitro и разделение меченых белков двумерным
электрофорезом (2-DE)
2.12. Вестерн блоттинг
2.13. Получение рекомбинантного белка GroES
2.14. Фосфорилирование GroES in vitro
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Создание коллекции мутантов по генам СТПК
3.2. Скрининг коллекции мутантов по генам СТПК методом нозерн-блот гибридизации
3.3. Изучение параметров роста и морфологических характеристик мутантов AspkH и AspkK, отобранных по результатам первичного скрининга
3.4. Анализ динамики экспрессии генов, индуцируемых тепловым стрессом, у мутантов по генам СТПК методом нозерн-блот гибридизации
3.5. Исследование динамики экспрессии стресс-индуцируемых генов у двойного мутанта AspkHI AspkK
3.6. Фосфорилирование фракции растворимых белков Synechocystis по серину и треонину в ответ на высокотемпературное воздействие
3.7. Идентификация фосфорилированных белков при помощи MALDI-TOFMS
3.8. Получение рекомбинантного белка GroES
3.9. Белок GroES - субстрат фосфорилирования in vitro для протеинкиназ SpkC/F/K
3.10. Серин-трсониновое фосфорилирование растворимых белков в клетках мутантов ДhrcA и Ahik34: возможное взаимодействие серин-треонииовых протеинкиназ с транскрипционным фактором НгсА и/или с гистидинкиназой Hik
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений
2-DE - двумерный электрофорез БТШ - белки теплового шока (Hsp)
ДТТ - дитиотреитол
ПААГ — полиакриламидный гель
СТПК - серин-треониновые протеинкиназы
ФМСФ - фенилметилсульфонил фторид
ЭГТА - этиленгликольтетрауксусная кислота
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
CIRCE - консервативный инвертированный повтор, ^wc-элемент, контролирующий экспрессию шаперонов
HEPES - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота Hik - гистидиновая киназа (histidine kinase)
HrcA - транс-фактор, регулятор CIRCE элементов MES - 2-(М-морфолино)этансульфоновая кислота SDS додсцил-сульфат натрия SpkA-L — серин-треониновая протеинкиназа A-L ТС А - трихлоруксусная кислота

благодаря гидрофобным взаимодействиям и водородным связям (Bhattacharya et al., 2009).
Для функционирования рассматриваемого комплекса (Рис. 3 В) необходимо присутствие еще двух адаптерных белков: GrpE и IIsp40. Hsp40 (DnaJ) принадлежит к классу весьма разнородных белков и состоит из большого количества функциональных доменов. Один из доменов (J домен) является консервативным среди всех представителей данного класса. Этот участок необходим для взаимодействия Hsp40 и Hsp70. Наиболее важными свойствами Hsp40 является возможность связываться с полипептидом, а также стимулировать гидролиз АТФ. Современная модель взаимодействия этих белков предполагает, что полипептид первоначально присоединяется к Hsp40. После чего образовавшийся комплекс ассоциирует с Hsp70/AT, субстрат переносится в пептидсвязывающую впадину Hsp70 и оказывается запертым в данном сайте из-за последующего гидролиза АТФ, стимулируемого Hsp40. Функциональный цикл Hsp70 завершается обменом АДФ на АТФ. Присутствие Hsp40 ускоряет гидролиз АТФ (Walter & Buchner, 2002).
Функция GrpE заключается в том, что он понижает сродство Hsp70 к нуклеотидам. Процесс связывания нуклеотида происходит в две стадии: первоначально GrpE присоединяется к Hsp70 и таким образом вытесняется присоединенный АДФ. После этого связывание АТФ с Hsp70 стимулирует освобождение GrpE из комплекса. В настоящее время считается, что главная функциональная роль Hsp70 заключается в связывании несвернутых белков, которые впоследствии проходят процесс фолдинга посредством других шаперонов GroE или Hsp90.
Шаперонная система Hsp90 (HtpG).
Эта система присутствует как у про-, так и у эукариот. Причем в отличие от многих других шаперонных систем эукариотический аналог Hsp90 исследован гораздо лучше. В частности это связано с тем, что Hsp90 совместно с рядом ко-