Клеточные и физиологические механизмы инициации боковых корней у кабачка : Cucurbita pepo L.

• Автор: Ильина, Елена Леонидовна
• Шифр специальности: 03.01.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 205 с. : ил.

Оглавление
Список сокращений
Введение
Глава I. Обзор литературы
1. Структурные аспекты инициации примордиев боковых корней
1.1. Стратегии инициации примордиев боковых корней у цветковых растений
1.2. Планы первых делений у представителей стратегий, различающихся положением зоны инициации боковых корней
1.3. Факторы, определяющие положение примордия бокового корня по отношению к группам проводящих тканей
1.4. Участие рецептор-подобных протеин-киназ в определении положения примордия
бокового корня относительно окружающих его клеток
1.5. Факторы, детерминирующие клетки перицикла к инициации примордия бокового корня
2. Роль фитогормонов в инициации и развитии примордия бокового корня
2.1. Роль ауксина в инициации и развитии примордия бокового корня
2.2. Роль цитокининов в инициации и развитии примордия бокового корня
2.3. Взаимодействие фитогормонов при инициации и развитии бокового корня
3. Композитные растения как модель для изучения физиологических и молекулярногенетических механизмов развития корня
3.1. Теоретические аспекты агробактериальной трансформации растений
3.2. Использование метода агробактериальной трансформации штаммами АоЬаМегшт rЫzogenes для фундаментальных исследований и в биотехнологии
3.3. Технологии трансформации растений штаммами АоЬаіїегіит rhizogenes
3.4. Агробактериальная трансформация Тыквенных штаммами Agrobacterшm rhizogenes
3.5. Использование промоторов генов первичного ответа на фитогормоны в изучении
процессов развития корня
4. Заключение
Глава И. Материалы и методы
1. Материал
1.1. Растительный материал и условия выращивания растений
1.2. Штаммы микроорганизмов
1.3. Условия культивирования микроорганизмов
2. Молекулярно-генетические методы исследования
2.1. Выделение плазмидной ДНК из Escherichia coli
2.2.Выделение плазмидной ДНК из Agrobacterium rhizogenes
2.3. Выделение общей ДНК из Agrobacterium rhizogenes
2.4. Выделение общей ДНК из растительных тканей
2.5. Полимеразная цепная реакция
2.6. ПЦР с колонией
2.7. Разделение фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле
2.8. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.9. Приготовление компетентных клеток Escherichia coli
2.10. Трансформация компетентных клеток Escherichia coli
2.11. Приготовление компетентных клеток Agrobacterium rhizogenes
2.12. Трансформация компетентных клеток Agrobacterium rhizogenes
3. Введение предшественника синтеза ДНК в ткани проростков кабачка
4. Создание генетических конструкций для визуализации ответа на ауксин и
ЦИТОКИНИНЫ
4.1. Построение эксперимента по визуализации ответа на ауксин и цитокинины
4.2. Получение генетической конструкции для визуализации ответа на ауксин
4.3. Получение генетической конструкции для визуализации ответа на цитокинины
5. Агробактериальная трансформация растений штаммами Agrobacterium rhizogenes
5.1. Получение асептического материала
5.2. Трансформация растений Agrobacterium rhizogenes
5.3. Отбор ко-трансформированных корней
5.4. Анализ активности репортерного белка GFP
5.5. Гистохимическое окрашивание на активность p-глюкоронидазы
6. Методы микроскопии
6.1. Начальные этапы пробоподготовки
6.2. Приготовление и анализ препаратов в воске Стидмана
6.3. Приготовление и анализ препаратов в гистологической эпоксидной смоле Technovit7100
6.4. Приготовление и анализ толстых срезов сегментов гипокотиля или кончиков корня
7. Обработка проростков кабачка экзогенным ауксином или блокатором активного транспорта ауксина
7.1. Постановка эксперимента по обработке проростков кабачка экзогенными агентами
7.2. Получение растительного материала
7.3. Фиксация и обработка материала
7.4. Оценка индекса инициации боковых корней
8. Статистические методы и компьютерные программы, используемые в работе
Г лава III. Результаты исследования

1. Изучение планов первых делений примордия бокового корня Cucurbita реро и их удаления от инициальных клеток рядов
2. Распределение ДНК-синтезирующих клеток в зоне первого периюшнального деления в главном корне Cucurbita реро
3. Создание модельных композитных растений Cucurbita реро для визуализации ответа на ауксин и цитокинины
3.1. Создание генетических конструкций для визуализации ответа на ауксин и цитокинины
3.2. Выбор участка проростка кабачка для инокуляции агробактериями
3.3. Получение композитных растений кабачка путём агробактериальной трансформации штаммами Agrobacterium rhizogenes
3.4. Фенотип композитных растений кабачка и ко-трансформированных корней
3.5. Подтверждение вставки Т-ДНК используемых генетических конструкций в геномную ДНК корней кабачка методом ПЦР
3.6. Изучение эффективности трансформации кабачка штаммами R1000 и MSU440 Agrobacterium rhizogenes
3.7. Изучение влияния промоторов AtUbqlO и 35SCaMJf на. экспрессию репортерных генов
4. Распределение ответа на ауксин и цитокинины при инициации и развитии примордия бокового корня Cucurbita реро
4.1. Анализ распределения ответа на ауксин при инициации и развитии примордия бокового корня в тканях ко-трансформированного корня кабачка (DR5::gfp-gusA)
4.2. Анализ распределения ответа на цитокинины при инициации и развитии примордия бокового корня в тканях ко-трансформированного корня кабачка
(ARR6: :gfp-gusA)
5. Влияние экзогенного ауксина и блокатора транспорта ауксина на инициацию и развитие примордиев бокового корня Cucurbita реро
5.1. Влияние экзогенного ауксина на инициацию и развитие примордиев бокового корня кабачка
5.2. Влияние блокатора транспорта ауксина на инициацию и развитие примордиев бокового корня кабачка
5.3. Оценка частоты индекса инициации боковых корней при воздействии экзогенного ауксина или блокатора транспорта ауксина
Глава IV. Обсуждение результатов
1. Анализ первых анатомических событий, ведущих к инициации примордия бокового корня кабачка
1.1. Планы первых делений при инициации примордия бокового корня
1.2. Положение первых делений при инициации примордия бокового корня относительно меристемы родительского корня
1.3. Смена плана деления при инициации примордия бокового корня
1.4. Инициация боковых корней в апикальной меристеме родительского корня как альтернативный путь инициации боковых корней

Обзор литературы

в апикальной меристеме корня создаётся неравномерное распределение ауксина, так что создаются условия, при которых меньшая чем обычно концентрация ауксина может запустить инициацию бокового корня. Под действием гравитации ауксин из клеток колумеллы поднимается по клеткам ризодермы и вызывает их растяжение в месте поворота. Интересно, что согласно данной модели, собственно накопление ауксина происходит на внутренней стороне сгиба, хотя корень формируется на внешней стороне сгиба (Lucas et al., 2008).
Таким образом, до настоящего времени остаётся невыясненным вопрос, под действием каких факторов происходит обособление клеток перицикла, участвующих в инициации бокового корня. Несомненно, что в таком комплексном физиологическом процессе, как смена программы развития клетки и переход на путь формирования новой меристемы, задействована сумма гормональных сигналов и воздействия факторов окружающей среды. Известно, что инициация примордиев боковых корней зависит от обеспеченности растения ассимилятами, в частности - сахарозой, а также наличия в почве компонентов минерального питания (Lloret, Casero, 2002). Считается, что наличие нитратов в почве стимулирует ветвление корневой системы, однако недавно было показано, что избыток нитрата вызывает временное ингибирование роста боковых корней за счёт подавления экспрессии генов циклинов В-типа и циклин-зависимых киназ (Okushima et al., 2011). Известно, что оксид азота стимулирует выход и рост боковых корней, при этом ингибируется рост главного корня, а при понижении уровня эндогенного оксида азота наблюдался обратный эффект. Показано, что поглотитель оксида азота предотвращает индукцию корнеобразования, вызванную экзогенным ауксином НУК. В тканях корня оксид азота детектировался на всех стадиях развития примордия бокового корня (Correa-Aragunde et al., 2004).
Подводя итоги, можно сказать, что в большинстве работ в качестве основного координатора всех сигналов, воспринимаемых растением, и инициацией новых меристем -в нужном месте и в нужное время, рассматривается именно ауксин, но при этом остаётся множество нерешённых вопросов по многообразию его физиологического действия.
2. Роль фитогормонов в инициации и развитии примордия бокового корня
Общепринято, что все процессы жизнедеятельности высших растений - от прорастания до гибели - контролируются фитогормонами. У растений выделяют пять основных групп фитогормонов: ауксины, цитокинины, гиббереллины, абсцизовая кислота и этилен. Все перечисленные фитогормоны в той или иной степени влияют на инициацию