Интерферирующая и антипролиферативная активности препаратов дцРНК в культурах опухолевых клеток человека различного происхождения

• Автор: Акимов, Иван Алексеевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 152 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Список сокращений
Введение
Глава 1. Коррекция нарушений клеточного цикла с помощью siPHK (обзор
литературы)
1.1. Введение: Регуляция клеточного цикла и ее нарушения как мишени для действия интерферирующих РНК
1.2. Регуляция клеточного цикла
1.2.1. Циклины и циклин-зависимые киназы
1.2.2. Регуляция активности циклинов и циклин-зависимых киназ
1.2.3. "Точки проверки ’’ клеточного цикла
1.3. Нарушения клеточного цикла и их причины
1.3.1. Her2 (c-erb-B2/Neu)
1.3.2. Циклин Bl
1.3.3. Протеинкиназа С (РКС)
1.4. Клеточная дифференцировка
1.4.1. Процессы клеточной дифференцировки
1.4.2. Индукторы клеточной дифференцировки
1.5. Ингибирование экспрессии генов с помощью siPHK
1.5.1. РНК— интерференция
1.5.2. Активация системы врожденного иммунитета под действием дцРНК
1.5.3. Клинические испытания препаратов на основе siPHK
1.5.4. Индукция клеточной дифференцировки с помощью siPHK
1.6. Заключение
Глава 2. Экспериментальная часть
2.1. Материалы и оборудование
2.1.1. Реактивы и препараты
2.1.2. Растворы и буферы, использованные в работе
2.1.3. Оборудование
2.1.4. Клеточные линии
2.1.5. Олигонуклеотиды, siPHK и длинные дцРНК
2.2. Методы
2.2.1. Ферментативный синтез длинных дцРНК
2.2.2. Приготовление дуплексов РНК
2.2.3. Очистка ферментативно синтезированных длинных дцРНК
2.2.4. Трансфекция клеток siPHK и длинными дцРНК
2.2.5. Определение количества живых клеток (МТТ-тест)
2.2.6. Микроскопический анализ
2.2.7. Определение доли мертвых и вошедших в стадию апоптоза клеток в популяции
2.2.8. Выделение суммарной клеточной РНК
2.2.9. Обратная транскрипция (получение кДНК)

2.2.11. Гель-электрофорез
2.2.11.1. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях
2.2.11.2. Электрофорез в ПААГ в нативных условиях
2.2.11.3. Электрофорез в агарозном геле
2.2.12. Полногеномный анализ экспрессии генов на микрочипах
2.2.13. Статистика
Глава 3. Интерферирующая и антипролиферативная активности препаратов дцРНК в культурах опухолевых клеток человека различного происхождения (результаты и обсуждение)
3.1. Выбор генов-мишеней и клеточных линий
3.2. Выбор препаратов siPHK и длинных дцРНК и стратегия исследования
3.3. Подавление экспрессии генов Her2 (c-erb-B2), CCNB1, РКС и с-Мус в клеточных линиях КВ-3-1, SK-N-MC, MCF-7 и HL-60 под действием siPHK и дцРНК
3.4. Пролиферация клеток линий КВ-3-1, SK-N-MC, MCF-7 и HL-60 после подавления экспрессии генов Her2, CCNB1, РКС и с-Мус
3.5. Исследование кинетики изменения уровня экспрессии генов Her2, CCNB1 и РКС в клетках линий КВ-3-1, SK-N-MC и MCF-7 после трансфекции siPHK
3.6. Проапоптотическая активность siHer, siCyc, dsMyc, dsEGFP иpoly(I:C)
3.7. Пролиферация клеток линий КВ-3-1, SK-N-MC и MCF-7 после восстановления исходного уровня экспрессии генов с-Мус, Her2, CCNB1 и РКС
3.8. Влияние ингибирования экспрессии генов CCNB1 и РКС на морфологические характеристики клеток линии SK-N-MC

3.9. Полногеномный анализ экспрессии генов на микрочипах в клетках БК-И-МС после подавления экспрессии генов ССИВ1 и РКС
3.10. Заключение
Выводы
Список литературы

собой врожденную регуляторную задачу в развивающемся организме [211,214]. Эта задача наиболее очевидна для эмбриональных стволовых клеток млекопитающих, которые обладают потенциалом к превращению в клетки любого типа во взрослом организме. Самыми важными регуляторами экспрессии определенных генов являются специфические к ДНК-последовательностям факторы транскрипции, участки метилирования ДНК, а также пмРНК (микро-РНК). Развитие стволовых клеток и клеток-предшественников в специализированные ткани в многоклеточном организме является сложным ступенчатым процессом.
Клеточная дифференцировка в высших организмах, как правило, необратима. Необратимость дифференцировки способствует фенотипической стабильности специализированных клеток, которая позволяет им выполнять соответствующие функции [ 220 ]. Недавние исследования показали, что дифференцированные клетки могут также проявлять экстраординарную изменчивость. Например, перенос специфических генов ответственных за плюрипотентность в соматические клетки способна обращать их в клетки, подобные стволовым, которые способны дифференцироваться в разнообразные ткани [221,222].
Нарушения дифференцировки могут иметь самые тяжелые последствия. В эмбрионе это может привести к различным физическим аномалиям, вплоть до его гибели. Во взрослом организме эти нарушения также могут приводить к нарушениям развития тканей и органов, а также к возникновению онкологических заболеваний.
1.4.2. Индукторы клеточной дифференцировки
В многоклеточном организме клеточную дифференцировку определяет множество факторов, таких как сигнальные молекулы различного типа, микроокружение клетки и др. [215,216].
Растворимые ростовые факторы являются наиболее хорошо изученной группой эффекторов клеточной дифференцировки (Табл. 3). Сюда входят примерно 20 семейств цитокинов человека и около 100 других различных факторов и их производных. Каждый фактор оказывает свое уникальное воздействие на процесс дифференцировки. Например, активин-А вызывает дифференцировку стволовых клеток в клетки скелетной и сердечной мышцы. Фактор роста нервов увеличивает долю нервных клеток в зародышевых листках. Стволовые клетки человека сами способны вырабатывать ростовые факторы для самих себя. Многие ростовые факторы являются морфогенами, то есть веществами, определяющими поведение и судьбу клеток-мишеней, их