Электрохимическое определение метаболической активности бактериальных и дрожжевых клеток и разработка микробных биосенсоров

• Автор: Хлупова, Мария Евгеньевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 105 с. : ил.

Список сокращений
Глава 1. Литературный Обзор
1.1. Электрохимические реакции клеток
1.2. Электрохимические методы
1.2.1. Исторический обзор
1.2.1.1. Импедансометрия
1.2.1.2. Потенциометрия
1.2.1.3. Технология топливных ячеек
1.2.1.4. Циклическая вольтамперометрия (ЦВ)
1.2.1.5. Амперометрия
1.2.1.Биосенсоры как перспектива использования электрохимических методов анализа 16 в микробиологических исследованиях и в аналитической химии
1.2.2.1. Биосенсоры для детекции микроорганизмов по продуктам метаболизма
1.2.2.2. Иммунобиосенсоры для детекции микроорганизмов
1.2.2.3. Геносенсоры для детекции микроорганизмов
1.2.2.4. Микробные биосенсоры для количественного определения различных 20 соединений. Биосенсоры для определения формальдегида (ФА)
1.2.2.5. Новые шаги в развитии технологии биосенсоров
1.3. Переход в покоящееся состояние — стратегия выживания. Мониторинг 23 физиологического состояния бактерий в стрессовых условиях
1.3.1. Перестройка метаболизма клеток в стрессовых условиях роста. Регуляция 23 изменений метаболизма системой «quorum sensing»
1.3.2. Покоящиеся формы микроорганизмов - формы неспорулирущих бактерий
1.3.3. Mycobacterium smegmatis - модель для исследования покоящихся форм рода 26 Mycobacterium
1.3.4. Методы определения покоящихся форм бактерий
1.3.4.1. Стандартные микробиологические методы подсчета микроорганизмов 28 (DVC)
1.3.4.2. Технология окрашивания с помощью флуоресцентных красителей 28 (также в сочетании с технологией “flowcytometry”)
1.3.4.3. Методы молекулярной биологии (RT-PCR, RT-SDA, FISH, NASBA, DEP)
1.3.5. Определение латентных патогенных бактерий. Проблема лечения 30 антибиотиками латентной формы туберкулеза

Глава 2. Материалы и методы
2.1. Реактивы
2.2. Объекты исследования
2.3. Выращивание бактериальных культур
2.4. Расчет концентрации бактерий и дрожжей
2.5. Контроль бактериального роста
2.6. Фильтрация микроорганизмов
2.7. Микроскопический анализ клеток
2.8. Электрохимический анализ клеток
2.8.1. Амперометрический метод определения количества клеток и уровня метаболической активности по величине тока, генерируемого клетками на электроде, прижатом к слою сконцентрированных на микробиологическом фильтре клеток, в присутствии редокс медиатора
2.8.2. Амперометрический метод с использованием платинового электрода, изготовленного техникой трафаретной печати
2.8.3. Определение скорости потребления кислорода клетками
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Электрохимический метод. Разработка метода
3.1.1. Быстрота исполнения метода
3.1.2. Сохранение интактности клеток при электрохимических измерениях.
Подбор прикладываемых потенциалов
3.1.3. Подбор медиатора для электрохимического анализа уровня метаболической активности клеток
3.1.4. Оценка доли электронного потока, отводимого из биологической цепи,
для проведения электрохимического анализа
3.1.5. Роль экзогенных и эндогенных субстратов в поддержании уровня метаболической активности клеток. Влияние состава среды на величину тока
3.1.6. Зависимость величины генерируемого тока от количества бактерий, осажденных на фильтре
3.2. Схемы медиаторного переноса электронов с элементов ЭТЦ клеток на электрод
3.2.1. Схемы медиаторного переноса электронов для прокариотических клеток
3.2.2. Схема медиаторного переноса электронов для эукариотических клеток
3.3. Динамика роста и перехода бактерий МусоЬас/епит $те^ай$ в стационарную фазу при культивировании в благоприятных условиях и в покоящееся состояние при культивировании в неблагоприятных условиях

3.3.1. Дифференциальное уравнение скорости роста популяции клеток и его решение. Применение методов математической статистики для описания экспериментальных данных
3.3.2. Динамика изменений метаболической активности бактерий, колониеобразующей способности, оптической плотности суспензии клеток и дыхательной активности. Анализ параметров кривых, сигмоидных и экспоненциальных кривых роста и спада, их физический и биологический смысл
3.3.3. Определение концентрации и удельной метаболической активности клеток
3.3.4. Анализ электрохимической и дыхательной активностей, отнесенных к единице оптической ПЛОТНОСТИ (ОБбОо)
3.3.5. Микроскопический анализ покоящихся форм бактерий
3.3.6. Определение количества покоящихся форм бактерий комбинированным методом, сочетающим определение электрохимической активности и колониеобразующих единиц (КОЕ)
3.3.7. Преимущества электрохимических методов анализа покоящегося состояния бактерий перед другими современными методами
3.4. Анализ действия противотуберкулезного антибиотика рифампицина на метаболическую и пролиферативную активность бактерий М. ше§р1айя с помощью разработанного амперометрического метода
3.5. Биосенсоры для определения формальдегида с использованием иммобилизованных дрожжевых клеток Натепи1а ро1утогр1ш
3.5.1. Макет кислородного биосенсора для определения концентраций ФА с использованием пермеабилизованных дрожжевых клеток
3.5.2. Биосенсор для определения формальдегида в присутствие редокс-медиатора 2,6-ДФИ с использованием интактных дрожжевых клеток Я. ро1утогрка КСА
3.5.3. Сохранение ЯА1)(Ф)Н-дегидрогеназной активности в пермеабилизованных дрожжевых клетках.
3.5.4. Зависимость метаболической активности интактных клеток дрожжей Я. ро1упюгр1га от культуральной среды
Заключение
Выводы
Список литературы

концентрации {КОЕ, клеток/мл). Умножая на число Фарадея (96500 кулон/моль), переводили величину активности потребления кислорода клетками в электрические единицы (А , мкА/мл).
Учитывая объем отфильтрованной суспензии (0,5 мл) и соотношение площадей осадка на фильтре (с1 = 7мм) и торца электрода (с1 = 3 мм): (3/7)2 = 0.184, оценивали число клеток, находящихся в зоне действия электрода и участвующих в электрохимическом процессе (У, клеток). Измеряли величину тока {Коп, мкА), который генерировали клетки при 37”С и приложенном потенциале +250 мВ. Отсюда, используя отношение величин тока, приходящихся на одну клетку (величины тока, полученную в прямом электрохимическом эксперименте, и величины тока, рассчитанную по потреблению кислорода), можно рассчитать ту долю потока электронов биологической цепи, которая отводилась на электрохимическую реакцию:
Расчеты были проведены для серии опытов. Данные, характеризующие культуру, и данные наших расчетов представлены в таблице 2. Следует иметь в виду, что для определения доли отвлекаемого потока электронов не требуется знание количества клеток или величины КОЕ. В предлагаемом расчете эта величина сокращается.