Эритроциты как носители ферментов для окисления этанола

• Автор: Тихонова, Анастасия Геннадьевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 105 с. : ил.

Оглавление
ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Морфология и физиология эритроцитов

1.2. Преимущества, достигаемые при использовании эритроцитов-переносчиков

1.3. Методы приготовления эритроцитов-переносчиков

Гипоосмотический гемолиз

Электропорация

Эндоцитоз

Увеличение проницаемости мембраны с помощью антибиотиков

Ультразвук
«Включение» белков с помощью низкомолекулярного протамина
Метод инкубации
Направленная доставка
1.4. Примеры использования нагруженных эритроцитов
Эритроциты как переносчики аналогов нуклеотида
Эритроциты как переносчики глюкокортикоидных аналогов
Эритроциты как переносчики лекарственных веществ
Эритроциты как переносчики белков
1.5. Попытки использования эритроцитов-биореакторов для окисления этанола
1.6. Метаболизм этанола
Абсорбция, распределение и элиминация этанола
Системы, метаболизирующие этанол
Токсическое действие алкоголя и его метаболитов
1.7. Сведения о ферментах, использованных в данной работе

Алкогольдегидрогеназа
Альдегиддегидрогеназа
ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.2. Методы
2.2.1. Исследование работы каскада ферментов вне клетки
2.2.2. Математическая модель
2.2.3. Приготовление суспензии эритроцитов человека
2.2.4. Приготовление суспензии эритроцитов мыши
2.2.5. Получение биорсакторов на основе эритроцитов человека
2.2.6. Получение биореакторов на основе эритроцитов мышей
2.2.7. Приготовление лизатов эритроцитов
2.2.8. Измерение активности ферментов
2.2.9. Приготовление перхлорных экстрактов проб
2.2.10. Измерения концентрации этанола и пирувата
2.2.11. Измерение эритроцитарных индексов
2.2.12. Изучение осмотической резистентности эритроцитов-биореакторов
2.2.13. Изучение распределения эритроцитов, нагруженных алкогольдегидрогеназой и альдегиддегидрогеназой, по плотностям
2.2.14. Измерение снижения активности «включенных» в эритроциты ферментов во время хранения
2.2.15. Измерение степени гемолиза эритроцитов-биореакторов во время хранения
2.2.16. Окраска эритроцитов мыши флуоресцеин-изотиоционатом и определение количества циркулирующих в кровяном русле флуоресцеин-изотиоционат-положительных клеток
2.2.17. Статистическая обработка данных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Сравнение теоретических расчетов с экспериментальными данными
3.2.Возможные причины, ограничивающие скорость окисления этанола эритроцитами-биореакторами в экспериментах in vitro
3.2.1.Оценка содержания алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы в эритроцитах для эффективной работы биореактора по окислению этанола
3.2.2. Зависимость скорости окисления этанола от присутствия пирувата в среде
3.2.3. Компенсация потерь НАД+ и НАДН
3.3. Зависимость скорости убыли этанола от концентрации пирувата
3.4. «Включение» ферментов в эритроциты
3.5. Исследование качества полученных клеток
3.5.1. Изучение осмотической резистентности эритроцитов-биореакторов, полученных методом одно-, двух- и трехступенчатого диализа
3.5.2. Изучение распределения эритроцитов, нагруженных алкогольдегдрогеназой и альдегиддегидрогеназой, по плотностям
3.5.3. Оценка активности «включенных» в эритроциты ферментов и гемолиз эритроцитов-биореакторов во время хранения
3.5.4. Определение количества циркулирующих в кровяном русле мыши ФИТЦ-положительных клеток
ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Микросомальная этанол-окислительная система (МЭОС1.
Lieber и его коллеги отметили, что у крыс, получающих этанол, пролифилирован гладкий эндоплазматический ретикулум. Данный факт привел к исследованию эндоплазматического ретикулума в присутствии ферментов метаболизирующих этанол. У крыс, кроликов и обезьян была описана цитохром Р-450 зависимая система, которая окисляет этанол и ацетальдегид. Система была воспроизведена в условиях in vitro, и было показано, что необходимыми компонентами являются: НАДФН-цитохром Р450 редуктаза, цитохром Р450 и фосфолипиды. Константа Михаэлиса для этанола равна 20 мМ, следовательно, данная система способствует нелинейной элиминации этанола при его высокой концентрации в крови, и, возможно, служит основным фактором, влияющим на повышение скорости метаболизма этанола, который является следствием хронического употребления алкоголя [147].
Катал аза.
Каталаза, которая расположена в печеночных пероксисомах, может окислять этанол до ацетальдегида при наличии перекиси водорода. Исследование ферментной реакции показало, что активность каталазы in vivo ограничивается наличием перекиси водорода. Т.к. скорость образования водорода в печени очень низкая, возможно, каталаза не играет значительной роли в метаболизме этанола [148].
Альдегиддегидрогеназа.
Образование ацетальдегида АДГ и МЭОС требует эффективного механизма устранения высоко реакционноспособного вещества. Печень млекопитающих содержит несколько изоферментов альдегиддегидрогепазы (АдДГ), которые могут окислять ацетальдегид до ацетата. Также существуют многочисленные молекулярные формы альдегиддегидрогеназы (АдДГ) в печени человека, но полагается, что только изоферменты класса I и класса II , кодирующиеся АдДГ1 (или АдДГ1А1 в новой номенклатуре) и АдДГ2 соответственно, включены в окисление ацетальдегида. АдДГ1 - цитозольный фермент, который широко распространен в тканях, включая мозг. Он имеет относительно низкую каталитическую эффективность для окисления ацетальдегида. АдДГ2 - это митохондриальный фермент, который сильно