Получение, характеристика и аналитическое применение антител к фуллерену C60

• Автор: Федюнина, Нина Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 110 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Механизм иммунного распознавания и индукции иммунного ответа
1.2. Естественные антигены и строение антигенных детерминант
1.3. Свойства техногенных наночастиц и проблемы оценки их 12 биобезопасности
1.4. Фуллерены, их основные структурные свойства, трансформация и 14 модификация в разных средах
1.5. Опыт получения антител против техногенных наночастиц
1.6. Пробоподготовка для проведения иммунохимических методов 26 анализа
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Материалы и оборудование
2.2 Методы исследования
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ГлаваЗ. Характеристика препаратов фуллерена С
Глава 4. Получение конъюгатов фуллерен С60-белок
Глава 5. Получение и скрининг антител к фуллерену С6о
5.1 Получение антител
5.2. Поликлональные антитела
5.3. Моноклональные антитела
Глава 6. Измерение констант иммунного взаимодействия на
иммуносенсоре В1асоге X
Глава 7. Разработка иммуноферментного анализа фуллерена и его
производных с использованием поли- и моноклональных антител
7.1. Взаимодействие конъюгированных форм фуллерена с
поликлональными антителами
1.2. Взаимодействие конъюгированных форм фуллерена с 61 моноклональными антителами
7.3. Взаимодействие водорастворимых производных фуллерена с

антителами
7. 4. Иммуноферментный анализ фуллерена Сбо
Глава 8. Разработка поляризационного флуоресцентного иммуноанализа
фуллерена
8.1. Синтез конъюгата фуллерена Сео с производным флуоресцеина
8.2. Контроль специфичности моноклональных антител к фуллерену С6!) 73 методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа
8.3. Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ фуллерена С60 с 74 использованием моноклональных антител
Глава 9. Иммуноферментный анализ фуллерена в биологических пробах
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений
АПФ - аминокислотное производное фуллерена
АС - антисыворотка
БСА - бычий сывороточный альбумин
ДМФА - диметилформамид
2,4Д - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота
ЖЭ - жидкостная экстракция
ЗНЧ - золотые наночастицы
ИФА - иммуноферментный анализ
НАФ - неполный адъювант Фрейнда
ПАМАМ - полиамидоаминные дендримеры
ПАФ - полный адъювант Фрейнда
ПФИА - поляризационный флуоресцентный иммуноанализ
ПЭМ - просвечивающая электронная микроскопия
СИТ - соевый ингибитор трипсина
ТГ - тиреоглобулин
ТМБ - 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин
ТНБС - тринитробензолсульфокислота
ТНЧ - техногенные наночастицы
ТСХ - тонкослойная хроматография
ФАмКК - фуллеренаминокапроновая кислота
ФБ - 50 мМ фосфатный буфер, pH 7,4, содержащий 0,1 М ИаС1
ФБТ - ФБ с 0,05% Тритона Х-100, pH 7
ЭДФ - этилендиаминфлуоресцеинтиокарбамат
СбоНуБп - молекулярно-коллоидный раствор гидратированного фуллерена - иммуноглобулин класса С ШРАС - Международный союз теоретической и прикладной химии
определяли экспериментально, выбирая максимальный отклик при введении реагента в буферных растворах с различным pH. Иммобилизацию реагентов на поверхности сенсорного чипа проводили согласно стандартной процедуре [176].
Чип активировали, пропуская смесь 1-гидрохлорид-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид : Х-гидроксисукцинимид, 1:1, объемом 70 мкл при скорости потока 5 мкл/мин. Затем при той же скорости пропускали раствор иммобилизуемого реагента (70 мкл) в выбранном буфере и концентрации. Непрореагировавшие активные группы блокировали 1 М этаноламином, pH 8,5 (70 мкл) при скорости потока 5 мкл/мин. Далее в ячейку прибора последовательно вводили: 1) антитела в концентрации от 4 до 200 нМ;
2) 10 мМ HEPES, pH 7,4, содержащий 150 мМ NaCl и 0,005% сурфактанта Р20;
3) регенерирующий реагент (10 мМ глицин-НС1, pH 2,0). Взаимодействия проводили в HEPES-P буфере (Biacore ЛВ, Швеция). Скорость потока варьировали от 5 до 75 мкл/мин.
Сенсорный сигнал регистрировали относительно контрольной ячейки с чипом без иммобилизованного на поверхности антигена. Остальные реагенты вносили в контрольную ячейку также, как в опытную.
2.2.14 Расчет констант взаимодействия антитело-антиген, полученных на
приборе Biacore X
Обработку результатов регистрации сенсорных сигналов, полученных на
приборе BlAcore X, проводили с помощью программы BIAevaluation в режиме
«Steady state affinity» по формуле
R _ KA*[An}*Rmx щ 1 +КЛ*п*Ап’
где Req - регистрируемый уровень связывания;
Rmax - максимальный наблюдаемый уровень связывания; п - стерический фактор;
[Ап] - концентрация аналита.