Сравнительное протеомное исследование белков человека, участвующих в обеспечении двигательных функций

• Автор: Иванов, Алексей Викторович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 144 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. Общие характеристики и постгеномные исследования белков человека, обеспечивающих двигательную функцию; биомедицинские аспекты (обзор литературы). И
1.1. Общие представления о «мажорных» белках человека с двигательными функциями
1.1.1 Основные белки, участвующие в мышечном сокращении. 1.1.2. Основные белки, обеспечивающие клеточную подвижность
1.2. Протеомные подходы к изучению белков, вовлечённых в обеспечении двигательных функций у человека. 1.2.1. Формирование и основные этапы в развитии протеомики человека 1.2.2. Протеомика мышечных белков человека в постгеномном периоде. 1.2.3. Протеомика белков, обеспечивающих клеточную подвижность
1.3. Основные подходы к поиску белковых биомаркеров, связанных с нарушениями двигательных функций
1.4. Рак простаты - актуальная проблема онкоурологии и поиски белковых биомаркеров рака простаты. 1.4.1. Общие характеристики рака простаты 1.4.2. Простат-снецифический анатиген и некоторые потенциальные белковые биомаркеры рака простаты
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1. Реактивы и биологические материалы
2.2. Методы культивирования клеток человека и получения препаратов клеточной биомассы для дальнейших исследований
2.3. Методы получения препаратов клеточных белков, составляющих ядерный протеом
2.4. Подготовка белковых экстрактов из образцов тканей и культивируемых клеток
2.5. Фракционирование белков двумерным электрофорезом. 2.5.1. Изоэлектрофокусирование и неравновесное фокусирование в полиакриламидном геле в градиенте pH, сформированном амфолинами. 2.5.2. Изоэлектрофокусирование в иммобилиновом градиенте pH. 2.5.3. ,813 Б -э л е ктро фо ре з в пластинах полиакриламидного геля. 2.5.4 Детекция белков на гелевых пластинах
2.6. Денситометрия и компьютерный анализ результатов двумерного электрофо

реза с использованием программ фирмы GE Healthcare
2.7. Масс-снектрометрическая идентификация белков
2.8. Определение концентрации белков
2.9. Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. Полученные результаты и их обсуждение
3.1. Протеомное изучение «мажорных» белков из биоптатов и аугоптатов т. vastus lateralis человека, формирование модуля «Белки скелетных мышц» для отечественной базы данных «Протеомика мышечных белков человека». 3.1.1. Результаты двумерного электрофореза белков из биоптатов и аугоптатов т. vastus lateralis человека и построение двумерной белковой карты (обобщенного синтетического изображения), 3.1.2. Результаты масс-спектромегрической идентификации белков скелетных мышц. 3.1.3. Встраивание модуля «Белки скелетных мышц» в отечественную базу данных «Протеомика мышечных белков человека»
3.2. Сравнительное изучение в культивируемых мышечных клетках человека отдельных групп белков, вовлеченных в обеспечение двигательных функций; нроте-омная идентификация потенциального биомаркёра - нового белкового продукта гена кальдесмона (CALD1)
3.3. Разработка подхода к протеомному анализу средне- и низкокопийных белков человека, вовлеченных в обеспечение двигательной функции. 3.3.1. Протеомный анализ общих ядерных белков, полученных из культивируемых миобластов человека, клеток рабдомиосаркомы и некоторых других клеточных линий. 3.3.2. Протеомный анализ гистонов, полученных из культивируемых миобластов человека, клеток рабдомиосаркомы и некоторых других клеточных линий. 3.3.3. Протеомный анализ постгистоновых ядерных белков, полученных из культивируемых миобластов человека, клеток рабдомиосаркомы и некоторых других клеточных линий
3.4. Сравнительный протеомный анализ потенциального биомаркёра - серпина Н1, в линиях клеток рабдомиосаркомы RD и А-204, а также ряда энителиоподобных клеточных линий человека
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
АА акриламид
а.о. аминокислотные остатки в белках
АСБ актин-связывающие белки
АТФ аденозинтрифосфат
ДГПЖ доброкачественная гиперплазия предстательной железы
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
кДа килодальтон
МБА метиленбисакриламид
ЛЦМ легкая цепь миозина
Мм молекулярная масса
мРНК матричная рибонуклеиновая кислота
ПААГ полиакриламидный гель
ПЖ(Ч) предстательная железа (человека)
ПИН простатическая интраэпителиальная неоплазия
ПСА персульфат аммония
ПЦР полимеразная цепная реакция
РНК рибонуклеиновая кислота
РПЖ рак предстательной железы
ТЕМЕД In ,N ,N ’ ,N ’ -гетрам етилэтилен диамин
ТМ тропомиозин
ТЦМ тяжелая цепь миозина
2D-DIGE двумерный дифференциальный электрофорез в геле
2D-PAGE двумерный электрофорез (в полиакриамидном геле)
ESI электроспрейная ионизация
ICAT метод изотопно меченных аффинных мишеней
IEF изоэлектрофокусирование
IEF-PAGE электрофорез в градиенте pH, созданном амфолитами
Ig иммуноглобулин
IPG-PAGE электрофорез в иммобилизованном градиенте pH
MALDI(-TOF) опосредованная матрицей (времяпролстная) лазерная десорбция
ионизация
MS масс-спектрометрия
MS/MS тандемная масс-спектрометрия
Mud-LC многомерная жидкостная хроматография
NCBI национальный центр биотехнологической информации в США
(National Centre for Biotechnology Information)
NEPHGE неравновесный электрофорез в градиенте pH
OMIM компьютерная база данных о мснделирующих признаках челове-

что в большинстве (но не во всех) проанализированных тканей присутствуют некоторые специфичные для мышц белки - саркомерный а-актин и десмип, образующий промежуточные филаменты мышечного цигоскелета, а также другие изоформы актина (ß, у) и ви-ментин. В последующем эти результаты были неоднократно подтверждены. Более того, в клетках рабдомиосарком удалось выявить ряд других мышечных белков, среди которых оказалось несколько регуляторов миогенной дифференцировки, а именно MyoD, MRF4, Myf5 и миогенин [Tonin P.N. et al. 1991; Parham D.M. 2001; Nanni P. et al. 2009; Eyden B. 2010 и др.]. Соотношение между различными регуляторными факторами в опухолевых клетках оказалось нарушенным, что рассматривалось как принципиально важное проявление трансформированности и, одновременно, причина приобретения клетками злокачественных свойств - повышенной инвазивности и способности к метастазированию. Параллельно были описаны мембрано-цитоплазматические выпячивания («protrusions»), связанные с миграцией клеток рабдомиосарком [Ito К. 1993]. Кроме того, Diomedi-Camassei F. et al. (2004) показали, что рабдомиосаркомы продуцируют несколько изоформ матрикс-пых металлопротеиназ (ММП-1, -2, -9), которые способны обеспечивать условия для повышенной клеточной инвазии. Важно подчеркнуть, что попытки определения тканевых ингибиторов этих ферментов (TIMP-1, TIMP-2) дали отрицательный результат. Надо отметить также то, что авторы обнаружили в образцах альвеолярных рабдомиосарком более высокие уровни ММП-1, -2, -9, чем у эмбриональных рабдомиосарком. Эти находки коррелировали с более агрессивным фенотипом у альвеолярных рабдомиосарком. Некоторые другие данные о роли изменений протеолитических ферментов в злокачественных опухолях будуг рассмотрены далее в подразделе 1.4.2.
Убедительное подтверждение сложившихся представлений о роли миогенных факторов в измениениях клеточной подвижности и формировании определенных патологических фенотипов рабдомиосаркомных клеток представили недавно Nanni Р. et al. (2009). Указанные авторы в модельных экспериментах показали, что принудительное усиление синтеза миогенина в культуре низкодифференцированных клеток рабдомиосаркомы человека RD/12 приводит ингибированию клеточной подвижности и образованию миотуб. При этом у экспериментальных животных (иммунодефицитных мышей) наблюдалось снижение роста опухолевых узлов и метастазирования.
В заключение этогоподраздела надо отметить, что в 2011 г. появилась публикация группы авторов, которые с помощью протеомных технологий провели прецизионное изучение инвадоподий и идентифицировали несколько десятков белков, включая ряд ассоциированных с цитоскелетными и мембранными структурами [Attanasio F. et al. 2011].