Изучение прооксидантного действия p66shc в клетках человека

• Автор: Галимов, Евгений Рафаэлевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 126 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Окислительный стресс
Источники АФК в клетке
НАДФН-оксидазы
Производство АФК в митохондиях
Роль комплекса I дыхательной цепи в продукции АФК
Роль комплекса III дыхательной цепи в продукции АФК
Антиоксидантная защита клетки
Неэнзиматические антиоксиданты
Глутатион
Аскорбат
а-токоферол
Липоевая кислота
Убихинол (коэнзим Ц10)
Ферментативные системы защиты от окислительного стресса
Супероксиддисмутаза (СОД)
Каталаза
Пероксиредоксины (Ргх)
Глутатион-пероксидаза (ЄРх)
Глутатион трансфераза
Тиоредоксин
Митохондриально-направленные антиоксиданты
Дробление митохондрий
Белковый аппарат слияния митохондрий
Фрагментация митохондрий
Регуляция фрагментации митохондрий
Механизмы гибели эукариотических клеток
Некроз,.,
Апоптоз
Участие каспаз в апоптозе
Активация апоптоза с участием мембранных рецепторов
Митохондриальный путь активации каспаз
Роль белков семейства Вс1-2 в апоптозе
Роль митохондриальной поры в клеточной смерти
РббэЬс
Р66, окислительный стресс и вызванный им апоптоз
Механизмы рбб-зависимого повышения внутриклеточных активных форм кислорода
рбб-зависимая активация мембранных НАДФН-оксидаз
рббзбс и регуляция экспрессии антиоксидантных ферментов
рббзбс и митохондриальный путь развития апоптоза
Митохондриальная локализация рббзЬс и его транспорт в митохондрии
Оксидоредуктазная проапоптотическая активность рббзЬс, приводящая к образованию АФК
Исследование изолированного СН2-СВ домена
рббБЙс как редокс-сенсор
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Используемые реактивы и препараты:
Используемые буферные растворы и среды:
Используемые расходные материалы:
Оборудование
Использованные культуры клеток
Пересев клеток
Замораживаие и размораживание клеточных культур
Пересев клеток для экспериментов
Определение концентрации клеток с помощью камеры Горяева
Обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР)
Лентивирусные конструкции
Генноинженерные манипуляции
Получение лентивирусных частиц, заражение и селекция клеток
Измерение активных форм кислорода
Измерение выживаемости клеток
Определение активности каспаз 3 и
Определение некротической гибели с помощью пропидий йодида
Определение колокализации белка Нурег-тйо с митохондриями
Окрашивание митохондриальной ДНК
Окрашивание митохондрий и оценка степени дробления митохондрий

Определение кривой роста клеток
Выделение препарата белка из эукариотических клеток
Метод «Western Blotting»
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Окислительный стресс, вызванный перекисью водорода в клетках карциномы толстого кишечника человека RKO и в иммортализованных фибробластах
Создание лентивирусных конструкций и получение стабильных линий клеток с генетическим нокдауном и оверэкспрессией p66shc
Роль p66shc в окислительном стрессе, индуцированном перекисью водорода
Действие p66shc на фрагментацию митохондриального ретикулума, индуцированную перекисью водорода
Эффект изменения экспрессии p66shc на гибель клеток, вызванную окислительным стрессом и аноикис
Роль p66shc в оксилительном стрессе, вызванном инкубацией в бессывороточной среде
Окислительный стресс и гибель клеток карциномы легких А549, вызванные антираковьм препаратом таксолом. Роль p66shc
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Антиапоптозные
,1.- — : 1. :1 ВН2 Ь-ШШШ Вс1-х ВН2 |—ИМ Нс1-л ВН2 I—I.- а! МсМ
Проапоптозные
мультидоменные ИВ— ВН1 —I ВН2 I—I .. 3 Вах
ВН1 I—| ВН2 [733 Вак
8Н2 ■
содержащие только ВНЗ-домен
ААи ВМ1рЗ/№х Рита Ыоха
Рис. 11. Схематическая классификация некоторых представителей семейства Вс1-2 белков. ТМ — обозначение С-копцевого гидрофобного домена у некоторых белков, который рассматривается как трансмембранный (по [268]).
До сих пор пс ясно, какие структурные черты определяют про- или антиапоптотические функции белков семейста Вс1-2. В зависимости от апоитозных стимулов происходит активация различных представителей семейства. Например, активированная через рецепторный путь каспаза-8, способна расщеплять белок В1с1, после этого происходит Ы-миристилироваиие его С-концевого фрагмента и В!с1 становится активным. При УФ-индуцированном апоптозе и негативной селекции тимоцитов происходит активация Внп. В норме белки Впп и ВтГ. связанные с цитоскелегными структурами (с микротрубочками и миозиновым комплексом, соотвестветтио) могут опосредовать клеточную смерть, вызванную откреплением от подложки (аноикис) [269, 270]. Другие члены группы белков, содержащих один лишь ВНЗ-домен способны только к транскрипционной активации. Так, белки Иоха и 1411113 находятся под контролем белка р53 [268].
В нормальных условиях проапоптогический белок Вах, расположен в цитозоле, в то время как Вак локализован на внешней мембране митохондрий