Роль посттрансляционных модификаций в регуляции активностей протеасом при генотоксическом стрессе в клетках К562

• Автор: Моисеева, Татьяна Николаевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 109 с. : ил.

Содержание:
1. Введение
1.1. Актуальность проблемы
1.2. Цели и задачи исследования
1.3. Основные положения, выносимые на защиту
1.4. Научная новизна полученных результатов
1.5. Теоретическое и практическое значение работы
1.6. Публикации
1.7. Апробация работы
1.8. Финансовая поддержка работы
1.9. Структура и объем работы
2. Обзор литературы
2.1. Протеасома
2.2. 26S протеасома
2.3. 20S протеасома
2.3.1. Гетерогенность популяции 20S протеасом
2.4. Регуляторные комплексы
2.4.1. 19S регуляторная частица (РА700)
2.4.2. 11S регулятор протеасом (РА28)
2.4.3. Регулятор протеасом РА200 (BlmlO)
2.4.4. Регулятор протеасом PI
2.5. Локализация протеасом в клетке
2.5.1. Протеасомы в ядре
2.6. Протеолитические активности протеасом
2.7. Убиквитин-зависимый протеолиз
2.8. Убиквитин-независимый протеолиз
2.9. Ингибиторы протеолитических активностей протеасом
2.10. Эндорибонуклеазная активность протеасом
2.11. Посттрансляционные модификации протеасом
2.11.1. Фосфорилирование

2.11.2. Ацетилирование
2.11.3. О-гликозилирование
2.11.4. Окисление серосодержащих аминокислот
2.11.5. Моноубиквитинилирование
2.11.6. Другие модификации субъединиц протеасом
2.12. Влияние физиологического состояния клетки на субъединичный состав протеасом
3. Материалы и методы
3.1. Культивирование клеток К
3.2. Выделение цитоплазматических протеасом
3.3. Выделение ядерных протеасом
3.4. Двумерный электрофорез белков
3.4.1. Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ)
3.4.2. Электрофоретическое разделение белков по молекулярным
массам в денатурирующих условиях
3.5. Вестерн-блоттинг
3.5.1. Перенос белков из геля на мембрану PVDF
3.5.2. Иммуноблоттинг с антителами к субъединицам протеасом
3.5.3. Отмывка мембран от антител для повторного окрашивания
3.6. Масс-спектрометрический анализ белков
3.7. Убиквитинилирование белков in vitro
3.8. Измерение пептидазных активностей протеасом
3.9. Приготовление клеточного экстракта
4. Результаты
4.1. Индукция повреждения ДНК в клетках К562 доксорубицином приводит к повышению химотрипсиноподобной и каспазоподобной активностей протеасом
4.2. Индукция повреждения ДНК в клетках К562 доксорубицином приводит к изменению спектра посттрансляционных

модификаций субъединиц протеасом
4.3. В клетках К562 присутствуют утяжелённые изоформы субъединиц
а5, аб и а
4.4. Убиквитинилирование протеасом in vitro приводит к подавлению
их пептидазных активностей
5. Обсуждение
5.1. Активация пептидазных активностей протеасом при индукции
повреждений ДНК доксорубицином
5.2. Посттрансляционные модификации субъединиц протеасом при
индукции повреждений ДНК в клетках К562 доксорубицином
5.2.1. Фосфорилирование
5.2.2. Убиквитинилирование
5.3. Субпопуляции ядерных и цитоплазматических протеасом
отличаются набором посттрансляционных модификаций
5.4. Регуляция способности протеасом к расщеплению белков
убиквитинилированием
6. Выводы
Список сокращений
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Литература

ингибитора I (ALLN), II (ALLM) и PSI. Они разработаны на основе пептидных альдегидов. Их главный недостаток заключается в том, что они могут ингибировать также и некоторые лизосомальные цистеиновые протеазы и кальпаин. Ко второму типу ингибиторов принадлежат лактацистин и его производные, которые в качестве псевдосубстратов присоединяются к гидрофобным группам каталитических центров ß-субъединиц и подавляют все три главные протеолитические активности протеасомы, но с различной кинетикой. В третью группу ингибиторов входят пептиды, содержащие С-концевой винилсульфон и связывающиеся ковалентно с активными центрами ß-субъединиц. Отдельно можно отметить ингибиторы на основе пептидов, несущих группы бороната, имеющие высокое сродство к каталитическим центрам протеасомы, но не блокирующие другие клеточные протеазы (Абрамова и др., 2002).
2.10. Эндорибонуклеазная активность протеасом.
Помимо АТФазной и деубиквитинилирующей активностей, необходимых для осуществления протеолитической активности, протеасомы также обладают эндорибонуклеазной активностью. Предположение о наличии у протеасом эндорибонуклеазной активности впервые было высказано на основании того факта, что фракции, содержащие протеасомы, были способны гидролизовать 18S рРНК, а в случае очищенных протеасом было показано их участие в процессинге пре-тРНК (Tsukahara et al., 1989).
При более тщательном анализе взаимодействия РНК с протеасомами обнаружилось, что 20S частицы могут специфически гидролизовать РНК вируса табачной мозаики. Продукты гидролиза представляли собой фрагменты дискретной длины и не являлись моно- или олигонуклеотидами, поскольку самый короткий из них мигрировал на уровне 120 нуклеотидов. Было также показано, что объединение протеасомных субъединиц в комплекс не является необходимым для проявления этой активности (Pouch et al., 1995).