Исследование свойств и механизмов формирования субпопуляций активированных тромбоцитов

• Автор: Топалов, Николай Николаевич
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 82 с. : ил.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Тромбоциты
Свертывание крови
Активация тромбоцитов
Основные виды ответов тромбоцитов при активации
Рецепторы тромбоцитов и основные пути внутриклеточной сигнализации
в тромбоцитах
Кальциевая сигнализация в тромбоцитах
Субпопуляции активированных тромбоцитов
Методики изучения субпопуляций активированных тромбоцитов
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы. В работе использовались следующие материалы
Выделение тромбоцитов
Загрузка тромбоцитов флуоресцентными красителями, чувствительными
к концентрации внутриклеточного кальция
Окраска тромбоцитов меченными антителами
Активация тромбоцитов
Проточная цитометрия. Настройка параметров прибора
Изучение кинетики формирования субпопуляций
Изучение роли секреции в формировании субпопуляций

Изучение роли межклеточных взаимодействий в формировании
субпопуляций
Обработка полученных результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ
Подбор краски, чувствительной к концентрации кальция
Кинетика кальция в субпопуляциях активированных тромбоцитов
Существование третьей субпопуляции активированных тромбоцитов. ..49 Кинетика формирования субпопуляций активированных тромбоцитов
Исследование свойств тромбоцитарных субпопуляций
Исследование роли секреции АДФ в формировании субпопуляций
Исследование роли секреции в формировании субпопуляций
Исследование роли межклеточных взаимодействий в формировании
субпопуляций
ОБСУЖДЕНИЕ

Тромбоциты - это безъядерные клетки крови, основной функцией которых является участие в свертывании крови, процессе, предотвращающем кровопотерю при повреждении кровеносного сосуда. Повреждение кровеносного сосуда приводит к активации системы гемостаза, включающей плазменное и тромбоцитарное звенья. Основные активаторы тромбоцитов это коллаген, высвобождающийся при повреждении сосуда, тромбин, ключевой белок каскада плазменного гемостаза, АДФ и тромбоксан А2, секретируемые тромбоцитами в процессе активации. При активации тромбоцит может изменять форму, подвергаться адгезии в месте повреждения, агрегировать с другими тромбоцитами, секретировать различные вещества, формировать прокоагулянтную поверхность, содержащую фосфатидилсерин, и отделять микровезикулы.
Интактные тромбоциты, как и большинство других клеток человека, поддерживают асимметрию плазматической мембраны. Отрицательно заряженные фосфолипиды фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин АТФ-зависимым образом переносятся с внешнего слоя мембраны на внутренний при помощи специфичных фосфолипидтранслоказ и флипазы. Однако в тромбоцитах эти ферменты не обнаружены. Также существуют указания на то, что в определенных условиях осуществляется обратный АТФ-зависимый перенос отрицательно заряженных фосфолипидов на внешний слой плазматической мембраны, однако фермент, который мог бы быть в этом задействован (уже названый скрамблазой), до сих пор не выявлен.
Способность тромбоцитов экспрессировать фосфатидилсерин на внешнем слое мембраны является чрезвычайно важной для сбалансированного функционирования всей системы гемостаза, поскольку фосфатидилсерин в составе мембраны обеспечивает нормальную работу многих белков плазменного гемостаза, значительно ускоряя их реакции. Пациенты с синдромом Скотта, врожденной патологией тромбоцитов, при

неукутанные тромбоциты (красные точки), не экспрессирующие фосфатидилсерин и имеющие сравнительно низкий уровень внутриклеточного кальция. Количество событий, не относящихся к этим двум группам, не превышает 1%. При активации же тромбоцитов в концентрации 2x10х мл’1 (рис. 3.4.Б) помимо двух вышеописанных субпопуляций формируется третья субпопуляция активированных тромбоцитов (синие точки), которая, как и укутанные тромбоциты, характеризуется экспрессией фосфатидилсерина, однако отличается низким уровнем внутриклеточного кальция.
Кинетика формирования субпопуляций активированных тромбоцитов
Для исследования кинетики формирования субпопуляций тромбоциты, загруженные Са2+-флуорофором Fura Red, взятые в концентрации 2x10s мл'1, окрашивали FITC-меченым аннексином V и активировали 100 нМ тромбина. Через заданные промежутки времени часть пробы отбиралась, разбавлялась в 10 раз и анализировалась на проточном цитометре. На рисунке 3.5. изображены точечные диаграммы флуоресценции аннексина V (ось абсцисс) и Fura Red (ось ординат) до активации (А), а также через 0,25 мин (Б), 1 мин (В), 2 мин (Г), 4 мин (Д), 8 мин (Е), 16 мин (Ж) и 40 мин (3) после активации. Процесс формирования субпопуляций начинается примерно через минуту после активации и далее продолжается вплоть до 40 минуты эксперимента. На рисунке 3.5.И,К представлены графики зависимости численности субпопуляций тромбоцитов от времени. Тромбоциты активировали 100 нМ тромбина в концентрациях 0,2x10s мл’1 (рис. 3.5.И) 2x10s мл'1 (рис. 3.5.К), оценивалась численность укутанных тромбоцитов (зеленые кривые), тромбоцитов третьей субпопуляции (синие кривые) и общего числа аннексин-положительных тромбоцитов (коричневые кривые). При активации тромбоцитов в концентрации 0,2x10s мл"1 формирование аннексин-положительных тромбоцитов происходит только за счет формирования укутанных тромбоцитов, тромбоциты третьей субпопуляции практически не образуются. При активации тромбоцитов в концентрации 2x10s мл’1