Четвертичная структура и конформационные изменения потенциал-зависимых калиевых каналов Kv2.1 и Kv10.2

• Автор: Гризель, Анастасия Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 136 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА I. СТРОЕНИЕ ПОТЕНЦИАЛ ЗАВИСИМЫХ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ,
ИХ КОНФОРМАЦИОННЫЕ ПЕРЕСТРОЙКИ И РОЛЬ
ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ ДОМЕНОВ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
7.1 Общее строение Kv каналов
1.2 Конформационные перестройки, происходящие при активировании Kv каналов
1.3 Особенности строения и функционирования некоторых типов потенциалзависимых калиевых каналов
1.3.1 Канал Kv2.1:
1.3.2 Канал Kvl0.2:
1.4 Метод электронной микроскопии макромолекул
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Материалы
2.1.1 Стандартные растворы
2.1.2 Среды
2.1.3 Вектор, штаммы и эукариотические клеточные линии, использованные в
работе
2.1.4 Маркеры размера и молекулярной массы
2.2.1 Наработка плазмид pMT3-Kv2.1АСТА. pMT3-Kv2.1АС и рМТЗ-КД0
2.2.2 Выделение плазмидpMT3-Kv2.1ACTA, рМТЗ-КД.1 АС ирМТЗ-КД0
2.2.3 Рестрикция векторов pMT3-Kv2.1ACTA, рМТЗ-КДААС и pMT3-Kv10
2.2.4 Аналитический электрофорез плазмидной ДНК в агарозном геле
2.2.6 Временная трансфекция эукариотических клеточных линий
трансфецирующим агентом - Metafecten™ PRO «Biontex» (Германия)
2.2.7 Условия культивирования эукариотических клеточных линий
2.2.8 Приготовление аффинной колонки с 1D4 антителами
2.2.9 Очистка каналов Kv2.1АС, Kv2.1АСТА и Kvl0
2.2.10 Электро форез в ПААГ
2.2.11 Окраска белковых гелей серебром
2.2.12 Вестерн блоттинг
2.2.13 Получение флуоресцентно-меченого аджитоксина 2 для тестирования
экспрессии каналов
2.2.14 Определение особенностей локализации каналов в мембране клеток
методом конфокальной микроскопии
2.2.14 Измерение параметров кластеров каналов в мембране клеток
2.2.15 Приготовление образцов для электронной микроскопии
2.2.16 Условия проведения ЭМ эксперимента
2.2.17 Компьютерная обработка изображений канала
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Экспрессия потенциап-зависимых каналов Kv2.1 и Kvl0
3.2 Флуоресцентные тесты экспрессированных каналов

3.2.1 Определение корректности фопдинга и эффективности трансфекции каналов Kv2.1 и Kvl0
3.2.2 Кластеризация Kv2 каналов в мембране клеток и влияние С-концевых доменов на этот процесс:
3.3 Выделение и очистка потенциал-зависимых каналов Kv2.l и Kvl0
3.4 Исследование структур каналов Kv2.1AC, Kv2.1 ACTA и Kvl0.2 методом ПЭММ
3.4.1 Получение трехмерных структур каналов Kv2.1ACTA, Kv2.1AC и Kvl0
3.4.2 Трехмерные структуры мутантных каналов Kv2.1ACTA и Kv2.1AC
3.4.3 Трехмерная структура канала Kvl0.2:
3.4.4 Kv2.1: Роль С-концевых цитоплазматических доменов в активации канала
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
а.о. - аминокислотный остаток
ИЮПАК - IUPAC - международный союз теоретической и прикладной химии
кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота
ММ - молекулярное моделирование
МРА — мульти-рефересный анализ
MCA — многомерный статистический анализ
ПААГ - полиакриламидный гель
ПЦР - полимеразно-цепная реакция
ПЭММ - просвечивающая электронная микроскопия макромолекул
РСА - рентгеноструктурный анализ
ЭМ - электронная микроскопия
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ЯМР - ядерно-магнитный резонанс
cNBD - cyclic nucleotide-binding domain - домен, связывающий циклические нуклеотиды
CTF — contrast-transfer function - частотно-контрастная характеристика электронного микроскопа
СТА - С-terminal activation domain - С-концевой активацонный домен
FRET - Fluorescence Resonance Energy Transfer - метод резонансного переноса энергии
флуоресценции
FSC - коэффициент объемной корреляции Фурье
GFP - green fluorescent protein - зеленый флуоресцентный белок
HCN - hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel - канал активируемый гиперполяризацией и открываемый циклическими нуклеотидами
HGNC - Hugo (Human Genome Organization) Gene Nomenclature Committee - комитет no генной номенклатуре организации по геному человека Kv — потенциал-зависимые калиевые каналы PD - pore domain - поровый домен
VSD - voltage sensing domain - домен чувствительный к потенциалу WT -wild type - дикий тип

известно три способа регуляции активности канала Kv2.l. связанных с его уровнем фосфорилирования. Кальцинурин дсфосфорилирует канал Kv2.l, что приводит к разрушению поверхностных кластеров и гиперполяризации мембраны (Misonou et al.. 2005: Mohapatra and Trimmer. 2006). сходный эффект наблюдается при
фосфорилировании сайта S440 киназой АМРК. (lkematsu et al., 2011), фоефорилирование же S603 и других сайтов киназой CDK5 вызывает обратный эффект (Cerda and Trimmer. 2011).
Последствия такой функциональной модификации потока ионов калия 1к во время возрастания возбудимости в нейронах могут приводить к увеличению рефракторного периода и снижению пиков потенциала действия (Surmeierand Foehring. 2004).
Рисунок 8. Схематическое изображение механизма
внутриклеточной сигнализации,
лежащего в основе зависимого от акти вности дефосфори л ирован ия
Kv2.1, и последующие изменения в локализации и функционировании канала Kv2.1. Kv2.l каналы гиперфосфорилированы и собраны в отдельные кластеры в плазматической мембране нейронов (верхняя часть рисунка) и имеют сравнительно слабые активационные и
инактивационные свойства. В контрольных условиях. нейроны имеют почти одинаковые свойства потенциала действия (верхняя часть рисунка. изображение ников потенциала действия). Возрастание возбуждения через активацию глутаматных рецепторов (GluR) приводит к потоку Са2' извне и из внутриклеточных запасов. Возрастание концентрации Са2* в цитоплазме приводит к активации кальцинурина (РР2В) (Са2'- и кальмодулин (СаМ)-зависимой фосфатазы), который затем дефосфорилируег каналы Кг2.1, в связи с этим происходит разрушение кластеров в мембране и изменение биофизических свойств каналов Kv2.1 (нижняя часть рисунка).
Дефосфорилированне К,2.1 приводит к быстрой активации потока ионов калия (1К), что приводит к супрессии потенциала действия (Misonou el al.. 2005, Mohapatra and Trimmer, 2006).
Изменнение нейрональной активности
(?P28;