Влияние шаперонов и краудинга на агрегацию белков

• Автор: Роман, Светлана Георгиевна
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 129 с. : ил.

Список сокращений
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Молекулярный краудинг
1.1.1 Определение и свойства явления
1.1.2 Влияние краудинга на скорость ассоциации молекул
1.1.3 Имитирование условий краудинга в экспериментах in vitro
1.1.4 Молекулярный краудинг, создаваемый осмолитами
1.2 Молекулярные шапероны
1.2.1 Шаперонин GroEL
1.2.1.1 Структура и свойства GroEL
1.2.1.2 Механизм действия GroEL
1.2.2 а-кристаллин
1.2.2.1 Структура и свойства а-кристаллина
1.2.2.2 Антиагрегационная активность а-кристаллина и модель взаимодействия а-кристаллина с белком-мишенью
1.3 Пролин
1.4 Модельная тест-система
1.4.1 Гликогенфософрилаза b из скелетных мышц кролика
1.4.2 Тепловая агрегация фосфорилазы Ь
1.4.3 Влияние а-кристаллина на тепловую агрегацию фосфорилазы b
Глава 2. Материалы и методы
2.1 Материалы
2.1.1 Химические реактивы
2.1.2 Выделение фосфорилазы b из скелетных мышц кролика
2.1.3 Препараты GroEL и а-кристаллина
2.2 Методы
2.2.1 УФ облучение гликогенфосфорилазы b
2.2.2 Измерение коэффициентов преломления
2.2.3 Измерение плотности растворов
2.2.4 Измерение динамической вязкости растворов
2.2.5 Измерение ферментативной активности фосфорилазы b
2.2.6 Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК)
2.2.7 Аналитическое ультрацентрифугирование
2.2.8 Измерение доли агрегированной фосфорилазы b

2.2.9 Динамическое лазерное светорассеяние (ДЛС)
2.2.10 Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ)
2.2.11 Аналитическая гель-фильтрация
2.2.12 Математический анализ экспериментальных данных
Глава 3. Влияние СгоЕІ. и пролина на тепловую агрегацию фосфорилазы Ь
3.1 Влияние ЭгоЕ!- на тепловую агрегацию фосфорилазы Ь
3.2 Влияние пролина на тепловую агрегацию фосфорилазы Ь
Глава 4. Влияние а-кристаллина и пролина на агрегацию УФ-облученной фосфорилазы Ь
4.1 Характеристика УФ-облученной фосфорилазы Ь
4.2 Влияние а-кристаллина на агрегацию УФ-облученной фосфорилазы Ь
4.3 Влияние пролина на агрегацию УФ-облученной фосфорилазы Ь
4.4 Совместное действие а-кристаллина и пролина на агрегацию УФ-облученной
фосфорилазы Ь
Глава 5. Влияние краудинга на агрегацию УФ-облученной фосфорилазы Ь и антиагрегационную активность а-кристаллина
5.1 Влияние краудинга на агрегацию УФ-облученной фосфорилазы Ь
5.2 Влияние краудинга на антиагрегационную активность а-кристаллина
Заключение
Выводы
Список литературы
Приложение А
Список сокращений
АДФ - аденозиндифосфат
АМФ - аденозинмонофосфат
АТФ - аденозинтрифосфат
ДДС-Na - додецилсульфат натрия
ДЛС - динамическое лазерное светорассеяние
ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия
ПААГ - полиакриламидный гель
ПЭГ-20000 - полиэтиленгликоль с молекулярной массой 20000 Да ТМАО - триметиламин N-оксид
УФ-Phb - облученная ультрафиолетовым светом гликогенфосфорилаза b ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота sHsp - small heat shock protein

немало работ.
Физиологическая роль фосфорилазы, ключевого фермента гликогенолиза в скелетных мышцах, состоит в энергетическом обеспечении мышечного сокращения, при этом источником энергии является глюкозо-1-фосфат, образующийся в ходе фосфорилазной реакции расщепления гликогена:
(а-1,4-глюкозил)„+1 + Р, о (а-1,4-глюкозил)„ + а-О-глюкозо-1-фосфат,
где п - число глюкозильных остатков. Реакция, катализируемая фосфорилазой, обратима, и отношение равновесных концентраций [глюкозо-1 -фосфат]/[Р|] равно 0.28 при pH 6.8. Однако в условиях in vivo фермент функционирует только в направлении фосфоролиза гликогена, так как концентрация неорганического фосфата в клетке существенно превышает концентрацию глюкозо-1-фосфата.
Фосфорилаза, составляющая до 2% от общего количества растворимых белков мышц, существует в покоящейся мышце в виде неактивной без АМФ нефосфорилированной форме (форме Ь). Димер фосфорилазы Ь состоит из двух симметрично расположенных идентичных субъединиц (см. рисунок 11). Молекулярная масса каждой субъединицы составляет 97432 Да. Пространственная структура фосфорилазы подробно изучена методом рентгеноструктурного анализа в группе Л. Джонсон [163-165]. Каждый мономер содержит одну полипептидную цепь, состоящую из 842 аминокислотных остатков и уложенную в компактную глобулу с радиусом 30 А. Каждый мономер обладает набором центров: каталитический центр, центр «запасания гликогена»,
аллостерический активаторный и аллостерический ингибиторный центры. Каталитически активной формой фермента является димер. Связи в зоне контакта мономеров в димере фосфорилазы b стабилизируются в основном гидрофобными взаимодействиями, что является причиной весьма прочного взаимодействия субъединиц фермента друг с другом и неспособности димера диссоциировать на свободные мономеры при физиологических условиях. В жестких условиях, отличных от физиологических, или при действии различных неблагоприятных факторов, димер может диссоциировать на мономеры, теряя каталитическую активность [166-173].
Кургановым и соавт. был установлен диссоциативный механизм денатурации фосфорилазы b [173]. В соответствии с этим механизмом процесс денатурации фермента включает в себя несколько последовательных стадий: стадию