Исследование гомологичной и негомологичной интеграции экзогенной ДНК в геном соматических клеток млекопитающих

• Автор: Щербакова, Ольга Глебовна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 114 с. : ил.

Оглавление.
Введение
Глава 1.Обзор литературы.
1.1 События, сопряжённые с трансфекцией экзогенной ДНК в клетки млекопитающих
1.2. Поли(АДФ-рибозилирование)
1.3. Роль ДНК топоизомераз в рекомбинации
1.4. Манипуляции с геномом мышей in vivo: техника "нокаута"генов, введение направленных мутаций
путём гомологичной рекомбинации
1.5.1. Центральная роль белка RecA в гомологичной рекомбинации у Escherichia coli
1.5.2. RecA-подобные белки
1.6. Белок Rad51 у млекопитающих: гомолог белка RecA
с множественными функциями
1.7. Репарация двунитевых разрывов в клетках млекопитающих
Глава 2. Материалы и методы.
2.1. Культура клеток
2.2. Плазмиды, использованные в работе
2.3. Получение нокаутирующих векторов различной структуры.
2.3.1. Получение однонитевой ДНК вектора pRV9.1
2.3.2. Получение фрагмента нокаутирующего вектора методом полимеразной цепной реакции(РСИ)
2.4. Получение /ip/t-нокаутных клонов F9
2.5. Обработки клеток ингибиторами
2.6. Анализ частоты случайной интеграции плазмиды в клетках китайского хомячка V79
2.7. Саузерн-блот-гибридизация
2.8. Получение клонов F9, экспрессирующих белок RecA

Глава 3. Результаты и обсуждение.
3.1. Исследование рекомбинации в клетках Р9 эмбриональной тератокарциномы мыши с помощью модельной системы направленной инактивации гена Лрг?
3.1.1. Анализ структуры локуса /?рг? в рекомбинантных клонах
3.2. Исследование влияния ингибиторов топоизомераз и поли(АДФ-рибозилирования) на частоту гомологичной и негомологичной интеграции экзогенной ДНК в клетках Р9
3.3. Автономная репликация плазмид, содержащих фрагменты ДНК
из а-полимеразного комплекса печени крысы
3.4. Использование нокаутирующих векторов различной структуры
3.5. Исследование влияния экспрессии белка ЯесА на частоту гомологичной рекомбинации
3.5.1. Получение трансгенных линий Р9,
экспрессирующих белок (ЧесА
3.5.2.Сравнение частоты направленной инактивации гена
в клетках Р9 и Р9-305
Выводы
Список литературы

Введение.
Адресная передача генетического материала в клетки высших эукариот путём гомологичной рекомбинации между вводимой в клетки ДНК и ДНК хромосом, или так называя техника gene targeting, продолжает оставаться предметом активного исследования, направленного как на понимание механизма гомологичной рекомбинации у высших, так и на решение ряда практических задач.
Возможность модифицировать геном эукариотической клетки путём гомологичного замещения интересующих исследователей участков ДНК предполагает такие перспективы, как анализ экспрессии генов с помощью мутирования их регуляторных элементов(Огкю S., 1998), структурнофункциональный анализ белков путём сайт-направленного мутагенеза in vivo, изучение заболеваний человека путём создания моделей этих заболеваний на трансгенных мышах (Braun K. and Sandgren E., 1998) и, наконец, идеальную генотерапию путём высокоточной замены повреждённых участков генома (Ланцов В.А., 1994).
Одна из основных трудностей на пути развития таких подходов - низкая частота гомологичной рекомбинации в соматических клетках млекопитающих. В сравнении с негомологичной эффективность гомологичной интеграции экзогенной ДНК в хромосомы соматических клеток млекопитающих на 2-3 порядка ниже (Doetschman Т.et al., 1987; Hasty Р. et al., 1991). О механизмах гомологичной и негомологичной рекомбинации и факторах, лимитирующих эти процессы в клетках высших эукариот, известно

В последние несколько лет был разработан крайне интересный подход введения направленных мутацмй в геном клеток мыши, механизм которого ещё не выяснен. Kmiech et al. (Kotani H. and Kmiech E.,1994) обнаружили, что белок RecA имеет повышенное сродство к гибридам ДНК-РНК. В интермедиате реакции переноса нити, катализируемой белком RecA , был обнаружен фрагмент РНК, в том случае, если один из рекомбинационных субстратов содержал транскрибируемый фрагмент ДНК и в реакционной смеси содержалась РНК-полимераза фага Т7 и РНК-нуклеотиды На основании этих наблюдений авторы разработали систему коррекции мутации в гене щелочной фосфатазы, расположенном на эписомной ДНК, с помощью коротких олигонуклеотидов, содержащих гибриды ДНК-РНК в месте вводимой мутации (Yoon K. et al., 1996). Восстановление функции гена с помощью таких олигонуклеотидов происходило с частотой 70%, что очень много даже для внехромосомной гомологичной рекомбинации, частоты которой значительно выше, чем частоты гомологичной рекомбинации в хромосомы.
Совершенно ошеломляющие результаты описаны при направленной коррекции точечных мутаций in vivo : при введении гибридных олигонуклеотидов, содержащих необходимую замену и заключённых в специфичные для транспорта в печень структуры, в хвостовую вену крысы была получена необходимая точечная замена в 40% клеток печени крысы (Kren В. et al., 1998). Механизм столь эффективного направленного мутагенеза остаётся неясным. Не все группы исследователей смогли повторить эти эксперименты. Однако число работ с использованием