Посттрансляционная модификация малой ГТФазы Rab7 : Механизм формирования стабильного тройного комплекса

• Автор: Яковенко, Андрей Романович
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 132 с. : ил.

1. Оглавление
1. Оглавление
2. Список используемых сокращений
3. Введение
4. Обзор литературы
4.1. Rab-белки
4.1 Л. Малые ГТФ-связывающие белки необходимы для мембранного
транспорта у Saccharomyces cerevisiae
4.1.2. Обнаружение малых Гтфаз, родственных Yptl/Sec4
в клетках млекопитающих
4.1.3. Rab-белки - члены суперсемейства Ras малых
ГТ Ф-связывающих белков
4.1.4. Семейство Rab состоит из большого числа изоформ
4.1.5. Строение Rab-белков
4.1.6. Внутриклеточное распределение Rab-белков
4.2. Посттрансляционная модификация Rab-белков
4.2.1. Модификация С-концевых аминокислот
4.2.2. Фосфорилирование
4.3. Регуляция Rab-белков
4.3.1. Ингибиторы диссоциации гуанинового нуклеотида
4.3.2. Факторы обмена нуклеотида
4.3.3. Белки-активаторы ГТФазной активности
4.4. Рабаптин-5
4.5. Рабфилин-За
4.6. Рабин 3
4.7. ЕЕА1
4.8. Функция Rab-белков
4.9. Rab-белки и механизм распознавания и слияния везикул
5. Материалы и методы
5.1. Материалы, использованные в работе
5.2. Стандартные молекулярно-биологические методы
5.2.1. Штаммы h.coli
5.2.2. Трансформация бактерий
5.2.3. Выделение плазмидной ДНК
5.2.4. Выделение вирусной ДНК
5.2.5. Рестрикция ДНК
5.2.6. ПЦР
5.2.7. Определение первичной структуры ДНК
5.2.8. Определение концентрации белка
5.2.9. Электрофорез белков
5.2.10. Культивирование клеток Spodoptera frugiperda
5.3. Конструкция плазмид и экспрессия рекомбинантных белков
5.3.1. Конструкция экспрессионных плазмид
5.3.2. Конструкция плазмиды и экспрессия Tev-протеазы
5.3.3. Конструкция плазмид и экспрессия Rab7
5.3.4. Конструкция плазмид и экспрессия С-концевых мутантов Rab7
5.3.5. Экспрессия Repi

5.3.6. Экспрессия RabrPT
5.4. Очистка рекомбинантных белков
5.4.1. Выделение рекомбинантной Tev-протеазы
5.4.2. Выделение рекомбинантного Rab7 и его мутантов
5.4.3. Выделение рекомбинантного Repl
5.4.4. Выделение рекомбинантной RablTT
5.5. Прочие методы
5.5.1. Нуклеотидный обмен
5.5.2. Дансилированные производные Rab7 и его мутантов
5.5.3. Родаминовые производные Rab7 и его мутантов
5.5.4. Определение геранилгеранилпирофосфата
5.5.5. Приготовление RabFFT, свободной от ГГпф
5.5.6. Получение комплекса RabriT с ГГпф
5.5.7. Измерение ГТФазной активности
5.5.8. Преципитация белков на Ni2t агарозе
5.5.9. Аналитическая гельфильтрация
5.5.10. Флуоресцентаная спектроскопия
5.5.11. Масс-спектрометрия
5.5.12. Математическая обработка результатов
6. Результаты
6.1. Доказательство существования комплекса Rab7»Rep 1 »RablTT
6.2. Стехиометрия тройного комплекса и влияние пренилирования на
его стабильность
6.3. Взаимодействие Rab7 и Repl
6.4. Определение аффинности RabrrT к комплексу Rab7»Repl
6.5. Влияние нуклеотидной формы Rab7 на аффинность RablTT
к комплексу Rab7»Repl
6.6. Значение С-концевой части Rab7 для распознавания RablTT
7. Обсуждение результатов
7.1. Взаимодействие Rab7 и Rep 1
7.2. Образование тройного комплекса Rab7»Rep 1 »RabrrT
8. Выводы
9. Список цитируемой литературы

2. Список используемых сокращений
АТСС от 'American Type Culture Collection'
АТФ аденозин-трифосфат
БСА бычий сывороточный альбумин
ВЭЖХ высоко эффективная жидкостная хроматография
г грамм
ГГпф геранилгеранил пирофосфат
ГГТ геранилгеранилтрансфераза
GDI от 'Rab-GDP dissociation inhibitor'
ГДФ гуанозин-дифосфат
ГТФ гуанозин-трифосфат
дНТФ дезоксинуклеотид-трифосфат
ДТТ дитиотреитол
дтэ дитиоэритриол
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ед единица
1,5-IAEDANS 5-((((2-йодоацетил)амино)этил)амино)нафталин-1 -сульфоновая кислота
ИПТГ Изодроиил-р-В-тиогалактопиранозид
кВ киловольт
кл константа диссоциации
кДа килодальтон
КМК критическая мицеллообразующая концентрация
л литр
Ц микрон
мА миллиампер
мант N-метилантранилоил
мг миллиграмм
мин минута
мкг микрограмм
мкл микролитр
мл миллилитр
мМ миллимоль
МОПС 4-морфолинпропансульфоновая кислота
мРНК матричная рибонуклеиновая кислота
НАДФ никотинамиддинуклеотид фосфат
нг нанограмм
нм нанометр
NSF N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein
об/мин обороты в минуту
ПААГ полиакриламидный гель
пмол пикомоль
ПЦР полимеразная репная реакция

в тексте не указано иначе. Для получения твердых сред в нее добавляли 1.5% агара. Ампициллин или карбенициллин использовали в концентрации 125 мг/л, канамицин в концентрации 50 мг/л.
5.2.2. Трансформацию бактерий осуществляли электропорацией в соответствии с инструкцией к прибору E.coli Puiser (BioRad). Вкратце, компетентные клетки получали следующим образом: высевали 400 мкл клеток E.coli из ночной культуры в 500млЬВ и подращивали 5-6 часов с хорошей аэрацией до OD6oo=0.7, затем осаждали центрифугированием 10 минут при 4 тыс. об./мин. Все дальнейшие операции проводили при 4°С. Осадок аккуратно ресуспендировали в 500 мл стерильного 10%-го глицерина и осаждали центрифугированием, промывали второй и третий раз соответственно 150 и 25 мл стерильного 10%-го глицерина. После центрифугирования (4000g, 8 мин.) осадок ресуспендировали в 1-3 мл 20%-го глицерина. Клетки хранили при -80°С в небольших аликвотах до нескольких месяцев без потери эффективности. К 40 мкл суспензии полученных клеток добавляли образец ДНК (2-2.5мкл). При проведении электротрансформации использовали следующие параметры: напряженность поля - 12.5 кВ/см, время импульса 5 мсек. После электропорации клетки ресуспендировали в теплой среде LB и подращивали 1 час на качалке при 37°С, а затем высевали на твёрдую селективную среду.
5.2.3. Выделение плазмидной ДНК осуществляли с использованием наборов фирмы Qiagen (Германия). Ночную культуру E.coli (500 мл в случае низкокопийных плазмид, 100 мл для высококопийных) центрифугировали 15 мин при 4000g, 4°С. Осадок клеток ресуспендировали в 10 мл буфера Р1 (50 мМ Трис-НС1, pH 8.0, 10 мМ ЭДТА, 100 рг/мл РНКазы А), добавляли 10 мл раствора Р2 (200 мМ NaOH, 1% SDS), аккуратно перемешивали и инкубировали 5 мин. при комнатной температуре. После этого добавляли 10 мл раствора РЗ (3 М ацетат калия, pH 5.5), перемешивали и инкубировали на льду 20 минут.