Использование аденовирусного вектора для доставки и регулируемой экспрессии гена интерлейкина-10 in vivo

• Автор: Мягков, Алексей Витальевич
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 101 с. : ил.

Содержание
Содержание
Список использованных сокращений
Введение
Обзор литературы
Основные мишени генной терапии аутоиммунных заболеваний
Экспрессия противовоспалительных цитокинов
Блокирование лигавд-рецепторных взаимодействий
Блокирование межклеточных взаимодействий
Подавление активации факторов транскрипции
Элиминация патогенных клеток
Восстановление повреждённой ткани
Методы доставки генетического материала
Использование чистой ДНК
Комплексы ДНК с полимерами
Вирусные системы доставки
Ретровирусы
Аденовирусы
Аденоассоциированные вирусы (ААВ)
Сравнительная характеристика экспериментальных моделей ревматоидного артрита
Адъювант-нндуцированный артрит
Кошагенчшдуцированный артрит

Протеогликанчшд>,цированньш артрит
Материалы и методы
Аденовирусные векторы
Модель ревматоидного артрита
Получение первичных синовиоцнтов
Измерение активности люциферазы
Определение активности промотора СЗ-компонента комплемента в первичных синовиоцитах in vitro, под действием LPS и про-воспалительных цитокинов
Анализ экспрессии гена иитерлейкина-10 первичными синовиоцитами, инфицированными аденовирусным вектором АйСЗЛЬ-Ю
Определение биологической активности интерлейкина-10 по его влиянию на ДНК связывающую и транскрипционную активность NF-kB
Анализ активности промотора СЗ-компонента комплемента in vivo
Инъекция аденовирусных векторов, содержащих ген интерлейкина
Сбор внутрисуставной жидкости
Определение содержания IL-10 во внутрисуставной жидкости
Измерение диаметра суставов
Подсчёт числа клеток во внутрисуставной жидкости
Определение концентрации интерлейкина-6 и интерлейкина-1 во
внут рисуставной жидкости
Результаты

Активность промотора СЗ-компонента комплемента в первичных крысиных синовиоцитах регулируется лнпополисахаридом и про-воспалительными цитокинами
Активность промотора СЗ-компонента комплемента in. vivo в суставах
животных после индукции экспериментального артрита
Регулируемая экспрессия гена интерлейкина-10, доставленного аденовирусным вектором AdC3/IL-10 in vivo
Терапевтический эффект экспрессии гена IL-10, доставленного в составе аденовирусного вектора Ае1СЗЯЬ-10 в модели экспериментального артрита
Обсуждение полученных результатов
Выводы
Список литературы

США) и 10% обезжиренного сухого молока. Затем мембрану помещали на один час в раствор поликлональных антител козла против человеческого интерлейкина-10 (SantaCruz, США) в ФСБ. содержащем 0.1% Triton Х-100. После инкубации с антителами против ГГ.-! 0 мембрану трижды отмывали 0,1% раствором Triton Х-100 в ФСБ, и затем инкубировали 1 час в растворе поликлональных антител кролика против IgG козла, конъюгированных с пероксидазой хрена. После трёхкратной отмывки 0,1% раствором Triton Х-100 в ФСБ детекцию IL-10 проводили с помощью хемолюминесцентного субстрата (ECL, Amersham, США).
Твердофазный иммуноферментный анализ. Концентрацию интерлейкина-10 в анализируемых образцах определяли методом «сэндвич» ELISA с помощью набора фирмы «BioSource» согласно протоколу, прилагаемому' фирмой-производителем.
Определение биологической активности интерлейкина-10 по его влиянию на ДНК-связывающую и транскрипционную активность SMF-kB
Определение ДНК-связывающей активности транскрипционного фактора NF-кВ. Первичные крысиные синовиоциты рассаживали в 100 мм чашки Петри в концентрации 6x105 клеток на чашку. Через 24 часа клетки преиикубировали с (ІЬ-ІО)-содержащими культуральными супернатантами, полученными от клеток, инфицированных аденовирусами AdRR5, AdC3/IL-10 или AdCMV/IL-10 и стимулированными 10 нг/мл TNFa (см «Анализ