Теломер-связывающий белок позвоночных : Характеристика и локализация

• Автор: Воронин, Алексей Петрович
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 73 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Основные положения выносимые на защиту
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Роль теломер в репликации
эукариотических хромосом
2. Роль теломер в организации хроматина
3. Известные теломер-связывающие белки
3.1. История открытия
3.2. Функции TRF1 и TRF2
3.3. Белки, связанные с белками TRF1 и
TRF2 в теломерном комплексе
4. Теломер-связывающий белок травяной
лягушки Rana temporaria
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Плазмиды
Биотинилирование ДНК
метод торможения в геле
Выделение ядер клеток печени и
ядерного матрикса
Экстракция ядерного матрикса
Ионообменная хроматография
Аффиная хроматография
Иммуноблоттинг
Проверка антител на перекрестное взаимодействие с двумя антигенами различной природы
(конкурентное связывание)
Иммунофлюоресцентная микроскопия
Комбинированная гибридизация in situ и иммунофлюоресцентная микроскопия

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Теломер-связывающая активность экстрактов ядерной оболочки ооцита лягушки и получение антител против комплексов
2.Мембранный теломер-связывающий белок (МТВР) имеет общую антигенную
детерминанту с кератинами
3.МТВР в препаратах ядерного матрикса мыши
4 . Специфичность связывания
5.Локализация шМТВР в интерфазных клетках культуры и в выделенных ядрах печени мыши
6.Локализация шМТВР на метафазной пластине
7.МТВР является ТКЫ2 и отсутствует в хроматине ооцита
8.шМТВР взаимодействует на иммуноблоте с антителами к телобокс-петиду и с антителами против консервативной части промежуточных филаментов
9.Компьютерный поиск гомологии между тМТВР/ТЕР2 и промежуточными филаментами
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. Консервативность МТВР/ТКБ2
2. Сходство МТВР/ТВЕ2 с промежуточными филаментами
3. Локализация МТВР/Т11Е2 и организация теломерных комплексов
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
AT - антитела
БСА - бычий сывороточный альбумин ДЭАЭ - диэтиаминоэтил
КСМ -135 мМ КС1, 20 мМ NaCl, 0.5 мМ ЭДТА, 0.1% Тритон Х-100,10 мМ трис-HCl рН
ПФ - промежуточные филаменты
ТМ - трис-магниевый буфер
ЭДТА - этилендиамин тетраацетат натрия ЯМ - ядерный матрикс
ЯО - ядерная оболочка
BCIP - 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate (5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат)
DAPI - 4,6 diamidinophenylindole (4,6 диамидофенилиндол)
FISH - fluorescence in situ hybridization (флуоресцентная гибридизация in situ)
FITC - fluoresceinisothiocyanate (флуоресцеинизотиоцианат)
IFA - intermediate filaments antibody (антитела к промежуточным филаментам)
МТВР - membrane telomer-binding protein (мембранный теломер-связывающий белок)
NBT - nitroblue tetrasolium (нитросиний теразолиевый)
PMSF - phenylmetylenesulfonylfluoride (фенилметиленсульфонил фторид)
SDS - sodium dodecylsulfate (додецилсульфат натрия)
SSC - solution sodium citrate (раствор цитрата натрия )
TBS - tris bufer solution (физ. раствор, забуференный грисом)
TRF - telomere repeat-binding factor (фактор, связывающий теломерный повтор)

Сравнивали прочность комплексов, образованных тМТВР и теломерными фрагментами тетрахимены и позвоночных. В этом случае в качестве специфичного конкурента использовали холодный, немеченый, выделенный фрагмент теломера тетрахимены (ТгОзо для конкуренции с комплексами, образованными обоими теломерными фрагментами. Для вытеснения из ДНК-белкового комплекса фрагмента позвоночных необходим в 2.5 раза больший избыток фрагмента, чем для вытеснения теломерного фрагмента тетрахимены ( рис. 7, б, 4-5, 9-10). Таким образом, связывание тМТВР с фрагментом позвоночных сильнее и специфичнее, чем с фрагментом тетрахимены.
5. Локализация тМТВР в интерфазных клетках культуры и в выделенных ядрах печени
мыши
Важно было убедиться с помощью иммуноцитохимических методов, что локализация выявленного белка в клетках мыши совпадает с локализацией теломер. Для этого с помощью антител к тМТВР и гибридизации с геломерным фрагментом одновременно окрашивался препарат иммортализованных фибробластов мыши, обогащенный метафазными пластинами, распластанными на стекле. Необходимость выбора препарата богатого метафазными пластинами объсняегся тем, что концевое расположение гибридизационного сигнала на хромосомах метафазных пластин являлось необходимым контролем успешности гибридизации.
Известно, что подобные препараты всегда содержат интерфазные клетки, которые в данном случае дали однозначный и четкий ответ. При окраске антителами против тМТВР и гибридизации с (ТзАОзДзз в интерфазных ядрах можно видеть совпадение выявляемых структур при наложении изображений (рис. 8). При использованном методе получения метафазных пластин клетки и ядра сильно расплющиваются на подложке, что и приводит к появлению материала, который можно обнаружить вне ядра. Не вызывает сомнений, однако, что АТ против не ДНК-связывающего эпитопа тМТВР пригодны для определения локализации теломер в интерфазных ядрах разных клеточных типов.
Препарат неповрежденного монослоя тех же клеток в культуре окрашен только на тМТВР (рис. 9). Видно, что окраска является внутриядерной. Эта картина очень похожа на картину распределения теломер в интерфазных ядрах клеток культуры, полученную с помощью метода FISH (Chong et al., 1995, Henderson et al., 1996). Однако при окраске, кроме точек можно видеть их слитые поля (рис. 9).