Регуляция активности транскрипционных факторов семейства REL в эмбриональных фибробластах крысы, трансформированных парой комплементирующих онкогенов EIA+cHA-RAS

• Автор: Дариева, Зульфия Абдурашитовна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 126 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Глава 1. Введение.
1.1 Актуальность проблемы
1.2 Цель и задачи исследования
1.3 Научная новизна полученных результатов
1.4 Теоретическое и практическое значение работы
1.5 Апробация работы
Глава 2. Обзор литературы.
2.1. Общая характеристика фенотипа трансформированных клеток
2.2 Онкобелки раннего района аденовирусов человека
2.3 Молекулярные механизмы иммортализующего и трансформирующего действия онкопродуктов раннего района в клетках грызунов
2.4 Особенности комплементации El А с онкогенами cHa-ras и El В
2.5 Функттии Ras белка в проведении сигнала и трансформации клеток
2.6 Пути передачи сигнала с клеточной поверхности в ядро
2.7 Свободные радикалы и их роль в передаче сигнала
2.8 Регуляция активности протеин киназных каскадов дефосфорилированием
2.9 Организация транскрипционного комплекса NF-кВ и его внутриклеточная локализация
2.10 Регуляция активности транскрипционного комплекса NF-KB
2.11 Сигнальные каскады, вовлеченные в активацию NF-КВ
Глава 3. Материал и методы.
3.1 Клеточные линии
3.2 Плазмиды и перенос генов

3.3 Ядерные экстракты
3.4 Анализ ДНК-связывающей активности ТЧБ-кВ в ядерных экстрактах
3.5 Антитела
3.6 Электрофорез и иммуноблоттинг
3.7 Иммунофлуоресценция
3.8 Иммунопреципитация
3.9 Регуляция активности протеинкиназы
3.10 Способность факторов роста сыворотки стимулировать пролиферацию
Глава 4. Результаты.
4.1 Ядерная аккумуляция №-кВ/11е1А в Е1 А+сНа-газ трансформантах
4.2 ДНК-связывающая и трансактивирующая активность №-кВ в нормальных и Е1А+сНа-газ трансформированных клетках
4.3 Е1А белки физически взаимодействуют с трансактивирующей субъединицей р65/Яе1А транскрипционного комплекса ИЕ-кВ
4.4 УчастиеКаз-индуцированных сигнальных каскадов в регуляции активности НЕ-кВ
4.5 Особенности регуляции сигнальных каскадов в клетках Е1А+сНа-газ
4.6 Особенности регуляции клеточной пролиферации нормальных фибробластов и трансформантов Е1А+сНа-гая
Глава 5. Обсуждение результатов
Выводы
Список литературы

Глава 1. ВВЕДЕНИЕ
1.1 Актуальность проблемы.
Стремительный прогресс в изучении молекулярных механизмов канцерогенеза в последние десятилетия связан с открытием большой группы генов, которые были объединены под общим названием протоонкогенов. Было показано, что в нормальных клетках они участвуют в регуляции клеточной пролиферации на всех уровнях передачи митогенных сигналов: от рецепторов и сигнальных белков сигнальных каскадов (протеинкиназы sarc, raf, mos, erb-B) до ядерных транскрипционных факторов (rel, fos, jun). Мутации в протонкогенах превращают их в онкогены, что, как правило, нарушает строгую регуляцию передачи митогенных сигналов. Именно это свойство лежит в основе автономной пролиферации опухолевых клеток.
Открытие метода переноса генов в клетки эукариот позволило получить ряд новых данных о молекулярных механизмах канцерогенеза и идентифицировать клеточные мишени, поражение которых необходимо для трансформации клеток. В частности, было показано, что введение ядерного онкогена El А аденовируса 5 типа нарушает строгий контроль за прохождением клеток по циклу путем инактивации продуктов генов - опухолевых супрессоров (Weinberg, 1991) и изменения активности ряда транскрипционных факторов (АР-1, NF-кВ, ATF-2, ), регулирующих продвижение клетки по клеточному циклу (Hagmeyer, 1993). Для полной клеточной трансформации необходимо введение комплементирующего онкогена, например Ras (Ruley, 1983). Один из наиболее часто мутирующих в человеческих опухолях генов - протоонкоген cHa-ras

(RelA), p52, RelB, и c-Rel, имеющих в N-терминальном конце консервативный домен Rel (300 а.к.), необходимый для ДНК-связывания, димеризации и ядерной транслокации этих белков. Способность различных димеров узнавать слабо различающиеся NF-кВ -сайты в составе разных промоторов может в принципе обеспечивать дифференциальную регуляцию экспрессии многочисленных генов-мишеней. Три субъединицы транскрипционного NF-кВ комплекса - c-Rel, RelB и р65 (RelA) содержат трансактивирующие домены в С-терминальном конце (Schmitz et al., 1995) и активность их в димере зависит от степени фосфорилирования этого района. Гетеродимеры, содержащие эти субъединицы обладают высоким трансактивирующим потенциалом, согласно данным по тестированию репортерных плазмид с регуляторными элементами NF-кВ. В качестве трансактивирующего фактора наиболее распространен гетеродимер р50/р65, тогда как гомодимер р50/р50 способен лишь поддерживать транскрипцию на базальном уровне, а в некоторых случаях репрессировать ее.
В большинстве типов клеток, NF-кВ комплекс неактивен и секвестрирован в цитоплазме ингибиторами семейства 1кВ, которое включает: 1кВ-а, 1кВ-|3 и 1кВ-е, Вс1-3, белки-предшественники для р50 и р52 - рЮО и р105, а также вариант альтернативного сплайсинга р105 - 1кВ-у. Общий признак этих ингибиторных молекул - наличие в них анкириновых повторов, основные различия связаны с путями их инактивации. Анализ промотора 1кВ-а выявил в нем многократно повторенные NF-кВ сайты, что позволяло предполагать наличие авторегуляции, обеспечивающей строгий контроль активности NF-