Влияние низких температур и криопротекторов на структуру и функцию изолированной цитохромоксидазы

• Автор: Розанова, Екатерина Дмитриевна
• Шифр специальности: 03.00.22
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Харьков
• Количество страниц: 143 c. : ил

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Влияние замораживания-оттаивания на
белок-липидные комплексы и белки
1.2. Влияние состава растворителя и температуры
на белок-липидные комплексы и белки ... ІА
1.3. Структура и функция цитохромоксидазы ... 2А
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Глава 2. Материалы и методы
Глава 3. Влияние замораживания-оттаивания на
цитохромоксидазу
Глава А. Влияние солей на цитохромоксидазу
Глава 5. Влияние криопротекторов на цитохромоксидазу
5.1. Влияние криопротекторов науструктурнофункциональное состояние .дит-рхромоксидазы
5.2. Замораживание-оттаивание цитохромоксидазы в присутствии криопротекторов
Обсуждение
Выводы
Список литературы
Список сокращений
Одним из наиболее актуальных направлений современной криобиологии является изучение механизмов криоповреждения и криозащиты биологических объектов.
Анализ механизмов криоповреждений на различных уровнях биологической организации привел большинство криобиологов к выводу, что наиболее чувствительными к действию низких температур структурами являются биологические мембраны [5,7,8,59,62,1583. Однако молекулярные механизмы повреждения мембран при замораживании-оттаивании изучены недостаточно. Необходимым этапом выяснения молекулярных механизмов криоповреждения мембран является исследование влияния низких температур и сопряженных о их действием факторов на белок-липидные комплексы. Целесообразность таких исследований подтверждается данными об изменении активности ряда мембраносвязанных ферментов после замораживания клеток и клеточных органел [52,76,108,180] . Большой интерес для криобиологии представляет изучение криоповреждений мембран митохондрий, вследствие их высокой криолабильности [8 3 и существенной роли в обеспечении жизнедеятельности клетки. Ферментные системы, встроенные в мембраны митохондрий, осуществляют реакции окисления-восстановления, сопряженные е генерацией и аккумуляцией энергии [66 ] . Определяющая роль митохондрий в обеспечении энергетического баланса клеток позволяет ряду авторов считать, что именно их повреждение является основной причи-

ной гибели клеток при замораживании [1А7,162,178]
Одним из важнейших ферментов внутренней мембраны митохондрий является цитохром-с -оксидаза (ЕС 1.9.3.1) - терминальный участок дыхательной цепи, сопряженной с цепью окислительного фосфорилирования.
Исследование состояния этого фермента в тканях после замораживания свидетельствует о снижении его активности [52,53,180]. Работы, проведенные на изолированном липопротеиновом комплексе, показывают, что замораживание до -20°С может приводить к изменению структуры фермента [1А1,196]
Вместе с тем, остается невыясненным вопрос о взаимосвязи структурных и функциональных изменений цитохромоксидазы при замораживании-оттаивании. Поскольку процесс замораживания-оттаивания представляет собой целый комплекс физико-химических изменений, на характер которых может влиять и искусственная криозащита, неясно также, какие именно факторы и каким образом оказывают влияние на структуру и функцию фермента.
Действие низких температур и криопротекторов на изолированный липолротеиповый комплекс представляет интерес и с точки зрения теоретической криобиологии; в литературе имеются лишь единичные сообщения, посвященные изучению механизмов криоповреждения и криозащиты липопротеинов [21,197*].
В связи с вышесказанным, целью настоящей работы явилось выяснение характера структурно-функциональных изменений цитохромоксидазы, вызываемых действием низких температур, и выявление основных факторов криоповреждения и криозащиты фермента.
В задачи работы входило: изучение структурно-функциональ-

Рис.3.7. Температурная зависимость ТПДС в области
денатурацмонного перехода в 0,1М трис-НСС
а) контроль; б) после замораживания-оттаивания
-196°С). Результаты приведены в табл.3.6, из которой видно, что снижение активности наблюдается после охлаждения растворов фермента до -20 —30°С. На рис.3.8 приведены дифференциальные спектры ЦХО после охлаждения до этих температур, которые коррелируют с результатами,-полученными при изучении активности фермента.
Уменьшение светорассеяния в растворе также наблюдалось при понижении температуры до -20°С, что позволяет предположить, что
отщепление липидов также происходит в этой температурном районе,
который является зоной эвтектики - зоной, в которой создаются наиболее высокие концентрации растворенных веществ.