Молекулярно-генетический анализ междисковых районов политенных хромосом Drosophila melanogaster

• Автор: Шварц, Юрий Борисович
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 119 с. : ил.

Оглавление
Введение
Глава 1. Организация междисков политенных хромосом Diptera.
(обзор литературы).
1.1 Общие сведения об организации хромосом эукариот
1.2 Политенные хромосомы (общие сведения)
1.3 Морфологическая организация междисков
1.4 Молекулярная организация междисков
1.4.1 Количество и конформационное состояние ДНК в междисках
2.3.1. Транскрипционная активность междисков
1.4.3 Локализация определенных белков в междисковых районах
1.5 Генетическая организация междисков
1.6 Анализ морфологических структур, возникающих в районах политенных хромосом, трансформированных чужеродными фрагментами

Заключение и задачи исследования
Г лава 2. Материалы и методы.
2.1. Генетические линии дрозофилы и их ведение
2.2 Подготовка компетентных клеток E
2.3. Трансформация плазмидной ДНК в клетки E
2.4. Выделение и очистка нуклеиновых кислот
2.4.1. Выделение геномной ДНК
2.4.2. Выделение плазмидной ДНК

2.4.3. Быстрое выделение микроколичеств плазмидной ДНК для скрининга
большого количества клонов
2.4.4. Выделение фаговой ДНК
2.4.5. Выделение тотальной РНК из личинок дрозофилы
2.4.6. Выделение поли-А+ РНК
2.5. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозных и полиакриламидных гелях
2.6. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.7. "Спасение" интегрированных плазмид
2.8. Приготовление препаратов для световой микроскопии и гибридизации in situ
2.9. Мечение ДНК
2.10. Методы гибридизации нуклеиновых кислот
2.10.1. Саузерн-блот гибридизация
2.10.2. Нозерн-блот гибридизация
2.10.3. Флуоресцентная ДНК/ДНК in situ гибридизация на политенных хромосомах (FISH)
2.11. Получение направленных делений
2.12 Определение последовательности нуклеотидов ДНК методом
Сэнгера
2.13. Скрининг геномной библиотеки
2.14 Выделение клеточных ядер из личинок дрозофилы
2.15 Получение препаратов ядерного матрикса
2.16 Связывание in vitro фрагментов клонированной ДНК с препаратами ядерного матрикса
2.17 Обработка ядер микрококковой нуклеазой
2.18. Компьютерный анализ последовательностей нуклеотидов в ДНК
Глава 3. Результаты.
3.1 Клонирование ДНК, прилежащей к встройкам транспозонов в районах междисков 85D9/D10 и 86В4/В6
3.2. Сравнительный анализ последовательностей нуклеотидов в ДНК из районов междисков
3.3. Междиски политенных хромосом содержат участки ДНК, связывающиеся с ядерным матриксом in vitro
3.4. Исследование транскрипционной активности ДНК из районов
междисков 61С7/С8, 85D9/D10 и 86В4/В6
3.5 ДНК междисков политенных хромосом способна формировать нуклеосомы
Г лава 4. Обсуждение.
4.1 Клонирование и компьютерный анализ ДНК из междисковых районов
4.2. Междиски содержат ДНК, связывающуюся с ядерным матриксом
4.3. 5’ концы некоторых генов находятся в междисках
4.4. ДНК междисков упакована в нуклеосомы
Выводы
Список литературы,

встраивании транскрипционно неактивного материала транспозонов в районы междисков. Новые диски по своей морфологии ничем не отличаются от “натуральных” дисков, их аксиальный размер коррелирует с размером инсертированной ДНК. То же самое можно сказать и про пуфы, образующиеся при активации генов, входящих в состав транспозонов.
Был также проведен анализ двух районов, содержащих инсерции нативных P-элементов (Semeshin et al., 1989). В обоих случаях авторы наблюдали формирование междисков из материала P-элемента. Так в линии I(1)BP7S3 с инсерцией P-элементов в 8С и 10А районах, наблюдалось значительное увеличение междиска 8С1/С2 (на 0.43рт), в то время как в линии Vм, несущей инсерцию P-элемента в кодирующей часть гена vermilion (Searles, Voelker, 1986), происходило расщепление диска 10А1-2. Как было показано ранее, vennilion находится в левой половине диска 10А1-2 (Zhimulev et al., 1981а; 1981b) и находится приблизительно в 20 тпн от ближайшего 9F13/10A1-2 междиска (Kozlova et al., 1994). По мнению авторов, формирование декомпактных структур из материала P-элемента может быть связано с его транскрипцией в слюнных железах. К сожалению, ни в одном из описанных случаев такая активность не была подтверждена экспериментально.
Линии мух, несущие точно картированные инсерции транспозонов в междиски, можно использовать для клонирования ДНК из этих районов. Следующая экспериментальная стратегия была предложена и опробована в работе С. Демакова и соавторов (Demakov et al., 1993). Из ДНК мух, имеющих инсерцию транспозона в междиск 61С7/С8, была приготовлена библиотека клонов, проскринировав которую гибридизацией с фрагментом ДНК транспозона, был получен рекомбинантный клон, состоящий из материала транспозона и примыкающего к нему междиска. Последний использовали в качестве зонда для поиска клона, содержавшего полную ДНК междиска. Последовательность нуклеотидов в ДНК, прилежащей к точке встраивания