Генетический и биохимический анализ мутантов Arabidopsis thaliana (L. ) Heynh с измененной чувствительностью к окислительному стрессу

• Автор: Маманова, Лира Бакиевна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 162 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ.
Список сокращений.

Введение
Глава I. Литературный обзор
1.1. Окислительный стресс
Т 1.1. Активные радикалы кислорода, вызывающие окислительный стресс
1.1.2. Окислительный стресс, вызванный гербицидами
1.1.2.1. Норфлуразон
1.1.2.2. Плюмбагин
1.1.2.3. Ацифлуорфен
1.2. Антиоксидантные защитные системы растительных клеток
1.2.1. Ферментативные системы защиты от окислительного стресса
1.2.1.1. Супероксиддисмутазы
1.2.1.2. Каталазы
1.2.1.3. Пероксидазы
1.2.1.3.1. Функциональные особенности и внутриклеточная локализация аскорбатпероксидаз (АРХ)
1.2.1.3.2. Функциональные особенности и внутриклеточная локализация гваяколпероксидаз
1.2.2. Неферментативные системы защиты от окислительного стресса. 21 [.3. Использование трансгенных растений для изучения физиологичесских
и генетических механизмов устойчивости растений к окислительному стрессу
1.4. Использование мутантов для изучения физиологических и генетических механизмов устойчивости растений к окислительному стрессу
1.4.1. Мутанты, чувствительные к озону
1.4.2. Мутанты, чувствительные к ультрафиолету (УФ)
1.4.3. Мутанты, чувствительные к кадмию
1.4.4. Мутанты с изменённой чувствительностью к фитолатогенам

1.4.4.1. Мутанты, конститутивно экспрессирующие иммунный ответ и реакцию “гиперчувствительности”
1.4.4.2. Мутанты с конститутивным иммунным ответом, но без некротичесских пятен
1.4.4.3. Мутанты, не имеющие иммунного ответа
I.4.5. Мутанты, толерантные к гербицидам
Экспериментальная часть
Г лава И. Материалы и методы
II.1. Растительный материал
II.2. Методы
11.2.1. Выращивание арабидопсис в асептической и почвенной культуре
11.2.2. Метод отбора устойчивых к норфлуразону растений A.thaiiana
11.2.3. Метод определения чувствительности к НФ
11.2.4. Метод отбора чувствительных к плюмбагину мутантов и определения чувствительности к плюмбагину
11.2.5. Метод отбора ацифлуорфеновых мутантов и определения чувствительности к ацифлуорфену
11.2.6. Метод определения чувствительности к параквату
11.2.7. Метод определения чувствительности к паклобутразолу
11.2.8. Метод регистрации замедленной флуоресценции хлорофилла
11.2.9. Метод электрофоретического выявления изоформ пероксидаз (РХ)
и супероксиддисмутаз (SOD)
11.2.10. Метод определения активностей изоформ пероксидаз и супероксиддисмутаз
11.2.11. Морфологическая характеристика растений
11.2.12. Метод сканирующей электронной микроскопии
11.2.13. Методы статистического анализа
11.2.14. Методы генетического анализа

Глава ill. Результаты и обсуждение
111.1. Создание селективных систем для отбора мутантов с изменённой чувствительностью к агентам, вызывающим окислительный стресс
111.1.1. Влияние на проростки A.thaliana агентов, ингибирующих биосинтез пигментов в растениях
111.1.2. Влияние на проростки A.thaliana редокс-циклических агентов
111.1.3. Влияние салициловой кислоты на проростки A.thaliana
III. 2. Изучение толерантных к норфлуразону мутантов A.thaliana
111.2.1. Получение мутантов, толерантных к норфлуразону
111.2.2. Фенотипический и генетический анализ мутантов A.thaliana, толерантных
к норфлуразону
111.2.2.1. Морфологические особенности карликовых мутантов, толерантных к норфлуразону
111.2.2.2. Генетический анализ карликовых мутантов
111.2.2.3. Морфологические особенности некротических мутантов
111.2.2.4. Генетический анализ некротических мутантов
111.2.2.5. Мутанты nfz12, nfz18, nfz24, толерантные к НФ
111.2.2.6. Г енетический анализ мутанта nfz24
III.2.3. Изучение перекрёстной устойчивости к параквату мутантов, толерантных к норфлуразону
111.2.3.1. Влияние параквата на растения расы Dijon и карликовых мутантов, толерантных к норфлуразону
111.2.3.2. Влияние параквата на растения расы Dijon и мутантов nfz18 и nfz24
111.2.3.3. Влияние параквата на растения расы Dijon и некротических мутантов
ill.2.4. Влияние параквата на замедленную флуоресценцию хлорофилла в листьях растений расы Dijon и мутантов, толерантных к норфлуразону
III. 3. Изучение мутантов с изменённой чувствительностью к плюмбагину
111.3.1. Отбор мутантов с изменённой чувствительностью к плюмбагину
111.3.2. Морфологические особенности плюмбагиновых мутантов
111.3.3. Генетический анализ мутантов
Hi.3.4. Изучение чувствительности плюмбагиновых мутантов к параквату
III. 4. Изучение мутантов с изменённой чувствительностью к ацифлуорфену

(Ward E.R., et al., 1991). В то же время показано, что мутации Isd2, lsd4 вызывают клеточную гибель и появление спонтанных некрозов независимо от содержания С К (некрозы развивались и у двойных мутантов). А у Isd1, Isd6 и Isd7 мутантов на фоне гена NahG формирование некрозов было супрессировано (Neunschwander et al., 1995). Таким образом, для гибели клеток в этих мутантах необходима СК (Kauss Y., et al., 1992; Mauch-Mani В., et al., 1996; Ryals JA., et al., 1996).
Результаты, полученные от скрещиваний fsd мутантов с NahG растениями, противоречивы, так как они указывают на то, что формирование некрозов может происходить как до накопления СК, так и после накопления СК. Эти противоречия можно объяснить, если предположить, что не сама СК, а продуцируемая при её взаимодействии с катапазой перекись водорода играет основную роль в развитии реакции гиперчувствительности (Rao M.V., et al., 1997; Chamnoogpol S., et al., 1996; Neunschwander U., 1995; Leon J., et al.,1995). Таким образом, процесс индукции и развития иммунного ответа тесно связан с процессами, протекающими в растениях в ответ на воздействие окислительного стресса.
4.4.2. Мутанты с конститутивным иммунным ответом, но без некротичесских
пятен.
К этой фуппе относятся мутанты сіт (сіт2, сітЗ) A.thaliana (constitutive immunity) (Lawton K., et al., 1993; Ryals J.A., et al., 1996). Мутанты имеют увеличенный уровень салициловой кислоты (СК), конститутивную экспрессию генов PR, характеризуются устойчивостью к патогенной вирулентной бактерии P.syringae DC3000 и патогенному грибу P.parasiticae. В то же время, в отличие от мутантов первой группы у мутантов сіт отсутствуют некрозы. Исследования мутантов сіт показали, что накопление СК, устойчивость к P.parasiticae, экспрессия PR-генов ингибируются в сітЗ мутанте экспрессией гена NahG (Lawton К., et al., 1993).
4.4.3. Мутанты, не имеющие иммунного ответа.
Наряду с мутантами, имеющими повышенную устойчивость к патогенам, были получены мутанты A.thaliana, не имеющие иммунитета и характеризующиеся повышенной чувствительностью к патогенам (Ryals J A, et al., 1997):