Изучение противовирусной активности антисмысловых РНК и рибозимов в отношении инфекции, вызываемой вирусом алеутской болезни норок

• Автор: Файзулоев, Евгений Бахтиёрович
• Шифр специальности: 03.00.06, 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 109 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Алеутская болезнь норок.
1.1. Общие сведения об инфекции.
1.2. Хроническая форма алеутской болезни норок.
1.2.1. Симптомы и патологоанатомические изменения.
1.2.2.Тканевой тропизм и особенности вирусной
репродукции.
1.2.3.Плазмоцитоз и гипергаммаглобулинемия.
1.2.4.Патогенез гломерулонефрита, вызванного инфекцией
вируса алеутской болезни норок.
1.2.5.Роль антител в патогенезе алеутской болезни норок.
1.2.6.Возможная роль позднего промотора автономных парвовирусов в определении характера течения
заболевания.
1.3. Острая пневмония у новорожденных щенят норок
(легочная форма алеутской болезни норок).
1.3.1. Симптомы и патологоанатомические изменения.
1.3.2. Патогенез легочной формы заболевания.
1.4. Современное состояние диагностики и профилактики
алеутской болезни норок.
2. Молекулярно-биологическая характеристика вируса алеутской болезни норок.
2.1. Структура и стратегия репликации вирусного генома. ,
2.2. Структура и функции вирусных белков.
2.3. Структура и свойства вирионов вируса алеутской болезни

норок.
3. Комплементарно адресованные полинуклеотиды как антивирусные
агенты.
3.1. Антисмысловые олигодезоксинуклеотиды.
3.2. Антисмысловые РНК.
3.3. Рибозимы.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Материалы.
1.1. Клеточные линии, вирусы и бактериальные штаммы, 3
1.2. Плазмидные векторы.
1.3. Ферменты и другие реактивы.
2. Методы.
2.1. Основные генноинженерные методы.
2.2. Приготовление компетентных клеток E. coli и их
трансформация плазмидной ДНК
2.3. Электрофорез молекул ДНК в агарозном геле.
2.4. Полимеразная цепная реакция.
2.5. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.
2.6. Дот- и блот-гибридизационный анализ ДНК и РНК.
2.7. Реакция транскрипции.
2.8. Реакция расщепления РНК-субстрата рибозимом.
2.9. Культивирование клеточных линий и вируса.
2.10. Нейтрализация инфекционной активности вируса.
2.11. Электронная микроскопия.
2.12. Трансфекция клеточных линий методом кальций-фосфатной преципитации.
2.13. Выявление временной экспрессии гена ß-галактозидазы в клеточных линиях.
2.14. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Конструирование рекомбинантных плазмид для изучения противовирусного действия антисмысловых РНК и рибозимов.
1.1. Создание плазмидных конструкций с генами
антисмысловых и смысловых РНК.
1.2. Создание плазмидных конструкций для изучения каталитической активности рибозимов.
2. Изучение принципиальной способности созданных рибозимов расщеплять РНК-мишень in vitro.
3. Оптимизация условий культивирования вируса алеутской
болезни норок в клеточных линиях CRFK и FS.
4. Идентификация вируса, продуцируемого культурой клеток FS.
5. Разработка методики для оценки уровня вирусной репродукции в клетках с использованием метода дот-гибридизации ДНК.
6. Изучение противовирусной активности антисмысловых РНК в культуре клеток FS.
ВЫВОДЫ
Благодарности
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

действующих последовательностей вирусной геномной РНК. Так, рекомбинантные плазмиды, содержащие ген антисмысловой РНК против области димеризации-упаковки (i|/) геномной РНК вируса лейкоза Молони (MoMuLV) оказались эффективными антивирусными агентами как в клеточной культуре, так и у трансгенных по этому гену мышей (74). В другой работе асРНК против нетранслируемой R-U5 области вирусной РНК вируса лейкоза коров эффективно снижали вирусную репродукцию в культуре клеток (41).
В последнее время в научной литературе появилось несколько сообщений об успешных экспериментах по испытанию антивирусной активности асРНК на лабораторных животных - in vivo. Так, Han описал трансгенных по гену асРНК мышей, устойчивых к инфекции вируса лейкоза Молони (74). В Японии получена линия трансгенных мышей, экспрессирующих асРНК против мРНК нуклеокапсидного протеина вируса гепатита мышей (MHV), которые оказалась более устойчивыми к летальной инфекционной дозе MHV (127).
Ранее уже упоминалось исследование Xin с сотрудниками, в котором была предпринята попытка экспериментальной генной терапии вируса гепатита пекинских уток антисмысловыми модифицированными олигорибонуклеотидами (поли-2'-0(2,4-динитрофенил)-олигорибонуклеотид). Химическая модификация антисмысловой последовательности РНК длиной 20 нуклеотидов сделала её устойчивой к расщеплению рибонуклеазой А при сохранении способности образовывать гибрид с ДНК. Результаты эксперимента показали, что модифицированные асРНК полностью ингибировали вирусную инфекцию у всех
9 уток, которым ежедневно внутривенно вводили дозу асРНК (1мг/кг массы тела) в течение 25 дней. Состояние подопытных уток контролировали в течение
10 месяцев с момента обработки, и за этот период не было признаков возврата заболевания. Методом ПЦР было показано полное исчезновение вирусной ДНК из печени обработанных уток, а микроскопическое исследование свидетельствовало об исчезновении характерных для этой болезни гистологических изменений в печени (149).
В России на базе НИИ сельскохозяйственной биотехнологии и Биотехцентра РАСХН получены трансгенные кролики с геном асРНК против RU5 - нетранслируемой области геномной РНК вируса лейкоза коров (BJIK). В