Характеристика комплекса нейтральных рибонуклеаз яиц некоторых насекомых

• Автор: Проскурина, Ирина Константиновна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 153 c. : ил

ЖБОНЖШШ (Обзор литературы)
Биологическая роль рибонуклеаз
Множественные форш рибонуклеаз
Рибонуклеази насекомых
Применение рибонуклеаз
Изучение нуклеолитических ферментов в породно-гибридном аспекте
МАТЕРИАЛ И МЕТОДІ
Материал
Методы исследования
Приготовление экстрактов.растворимых белков яиц насекомых
Определение суммарной рибонуклеазной активности
спектрофотометрическим методом
Определение рибонуклеазной активности методом дискэлектрофореза в полиакриламидном геле
Определение суммарной дезоксирибонуклеазной активности спектрофотометрическим методом
Определение активности фосфодиэотеразы спектрофотометрическим методом
Определение активности кислой фосфатазы спектрофотометрическим методом
Определение молекулярной массы фермента методом гель-фильтрации

2.2.8. Определение молекулярной маосы фермента методом электрофореза в полиакриламидном геле с ДЦС-^а
2.2.9. Определение способа действия нейтральной ШКазы грены тутового шелкопряда
2.2.10. Определение положения концевого фосфата в продуктах гидролиза ЕНК, полученных в результате действия множественных форм нейтральной ШКазы грены тутового шелкопряда
2.2.11. Определение аминокислотного состава множественных
форм нейтральной ШКазы
2.2.12. Выделение суммарной РНК из грены тутового шелкопряда и печени крысы
2.2.13. Фракционирование методом электрофореза в полиакриламидном геле РНК грены тутового шелкопряда и продуктов ее деградации, полученных под воздействием тожественных форм РНКазы
2.2.14. Выделение ядерной фракции из.грены тутового шелкопря

2.2.15. Определение РНК орциновым методом
2.2.16. Определение ДНК до методу Бартона
2.2.17. Определение нуклеодротеиновой природы нейтральной
РНКазы грены тутового шелкопряда
ГЛАВА 3. ВЫДЕЛЕНИЕ МНОЖЕСТВЕННЫХ ФОРМ НЕЙТРАЛЬНОЙ РНКазы ИЗ
ГРЕНЫ ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА И ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ
СВОЙСТВ ОЧИЩЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ
3.1. Разработка метода выделения и очистки тожественных форм нейтральной РНКазы из грены.тутового шелкопряда

3.2. Физико-химическая характеристика и свойства множественных форм нейтральной РНКазы из.грены тутового шелкопряда
3.2.1. Комплексообразующая способность РЩСаз
3.2.2. Молекулярные массы множественных форм нейтральной
. РНКазы грены тутового шелкопряда
3.2.3. Зависимость активности множественных форм нейтральной РНКазы от pH инкубационной среды
3.2.4. Зависимость активности множественных форм нейтральной РНКазы от температуры и их термосталыюсть

V 3.2.5. Влияние ионов М& на активность множественных форм
нейтральной РНКазы грены тутового шелкопряда
3.2.6. Аминокислотный состав множественных форм нейтральной РНКазы грены тутового шелкопряда
3.2.7. Способ действия множественных форм нейтральной РНКазы грены тутового шелкопряда
3.2.8. Субстратная специфичность множественных форм нейтральной РНКазы грены тутового шелкопряда
3.2.9. Изучение воздействия множественных форм нейтральной РНКазы грены тутового шелкопряда на РНК грены
ГЛАВА 4. ГЕТЕРОГЕННОСТЬ НЕЙТРАЛЬНОЙ РНКазы В ЯЙЦАХ НАСЕКОМЫХ;
К0ШЛЕКС00БРАЗШЦАЯ СПОСОБНОСТЬ ФЕРМЕНТА
4.1. Исследование уровня суммарной активности нейтральной РНКазы в яйцах некоторых насекомых
4.2. Молекулярная гетерогенность и комллексообразующая способность нейтральной РНКазы в яйцах насекомых
ГЛАВА 5. БЫСТРЫЙ МЕТОД ПОЛУЧЕНИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕПАРАТОВ
НЕЙТРАЛЬНЫХ РНКаз

нола, уксусной кислоты и дистиллированной воды в соотношении 10:1:30 (по объему).
Выявление нейтральной рибонуклеазной активности белковых фракций проводили, инкубируя гелевые колонки в 0,5%-ном растворе дрожжевой ШК в трис-НС1 буфере (pH 7,2) в течение часа при 37°С. Ферментативную реа1щию останавливали добавлением I М раствора уксусной кислоты с последующей отмывкой буферной смеси и избытка уксусной кислоты дистиллированной водой. Субстрат окрашивали 0,2%-ным раствором метиленового голубого в 0,1 М ацетатном буфере (pH 4,7) в течение 20 минут. Избыток красителя отмывали 5%-ным раствором уксусной кислоты (10-12 часов), а затем дистиллированной водой до появления светлых полос, указывающих места локализации на колонках белков, обладающих нейтральной рибонуклеазной активностью /Филиппович и др., 1975/. Колонки хранили в 5%-ном растворе хлорной кислоты.
2.2.4. Определение суммарной дезоксирибонуклеазной активности спектрофотометрическим методом
Субстратом для определения дезоксирибонуклеазной активности служил препарат высокомолекулярной ДЖ из молок лосося (производство НИШ БАБ, г.Новосибирск). 0,2%-ный водный раствор ДНК денатурировали нагреванием при Ю0°С в течение 10 минут с последующим быстрым охлаждением в ледяной бане. I мл инкубационной смеси содержал 0,4 мг денатурированной ДНК и 0,2 -0,6 мг белка ферментного экстракта в 0,1 Ы ацетатном буфере pH 5,2 (при определении кислой ДНКазы) или 0,1 М глициновом буфере pH 10 (при определении щелочной ДНКазы). Пробы инкубировали при 37°С в течение 1,5 часа, ферментативную реакцию останавливали охлаждением в ледяной бане. Негидролизованную ДНК осаждали 2 мл охлажденного 0,5 М раствора хлорной кислоты,