Протеолитические ферменты семян сои

• Автор: Типисева, Ирина Анриевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 178 c. : ил

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
2.1. Протеолитические ферменты - общая характеристика
2.2. Протеолитические ферменты растений
2.3. Протеазы семян растений
2.4. Протеазы семян бобовых
2.5. Протеолитические ферменты соевых бобов
2.6. Белковые ингибиторы протеаз в растениях
2.7. Белковые ингибиторы семян растений как регуляторы активности собственных протеаз
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Характеристика объекта исследования
3.2. Обезжиривание измельченного материала
3.3. Проращивание семян сои
3.4. Определение белка по методу Лоури
3.5. Определение активности протеаз
по методу Ансона
3.6. Определение начальной скорости реакции, протеолиза сывороточного альбумина
3.7. Выделение протеаз сои
3.7.1. Выбор,экстрагента для извлечения,
протеаз сои
3.7.2. Выбор оптимального времени извлечения ферментов
3.8. Лиофилизация препаратов протеаз и белковых ингибиторов
3.9. Гель-хроматография препаратов протеаз
и ингибиторов
3.10.Ионообменная хроматография

ЗЛІ. Изоэлектрическое .фокусирование
3.12. Аффинная хроматография
3.13. Электрофорез в ПААГ
3.14. Получение зимограмм протеаз после диск-электрофореза в ПААГ
4. ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОТЕОЖТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ СОМ
4.1. Определение оптимума pH действия протеаз
4.2. Осаждение протеаз сои при изменении pH
4.3. Стабильность протеаз при хранении измельченного материала и препаратов ферментов
4.4. Влияние температуры на активность протеаз сои
4.5. Влияние активаторов и ингибиторов на протеазы сои
4.5.1. Влияние активаторов и ингибиторов
тиоловых протеаз
4.5.2. Влияние ингибиторов сериновых протеаз
4.5.3. Влияние ЭДТА на активность протеаз сои
4.5.4. Влияние'триптофана и тирозина на активность протеаз
4.5.5. Влияние Насе на активность протеаз
5. ОЧИСТКА ПРОТЕАЗ СОИ
5.1. Выделение и очистка нейтральных протеаз сои
5.1.1. Фракционирование протеаз сульфатом аммония
5.1.2. Осаждение нейтральных протеаз при подкислении
5.1.3. Ионообменная хроматография нейтральных протеаз
5.1.4. Схема очистки нейтральных протеаз
5.2. Выделение и очистка щелочных протеаз сои
5.2.1. Осаждение щелочных протеаз при подкислении
5.2.2. Ионообменная хроматография щелочных протеаз ,
5.2.3. Аффинная хроматография щелочной протеазы I
5.2.4. Схема очистки щелочных протеаз сои

6. ХАРАКТЕРИСТИКА. ОЧИЩЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ПРОТЕАЗ СОИ
6.1. Характеристика очищенного препарата нейтральных протеаз
6.1.1. Определение оптимума pH
6.1.2. Влияние активаторов и ингибиторов
6.1.3. Определение молекулярной массы
6.1.4. Определение однородности препаратов нейтральных протеаз методом электрофореза в ПААГ
6.2. Характеристика очищенного препарата щелочных
протеаз сои
6.2.1. Определение оптимума pH
6.2.2. Влияние активаторов и ингибиторов
6.2.3. Определение молекулярной массы
6.2.4. Определение однородности препаратов щелочных протеаз методом электрофореза в ПААГ
6.2.5. Определение изоэлектрической точки
щелочной протеазы
7. БЕЛКОВЫЕ ИНГИШТОШ ПРОТЕАЗ СОИ И ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИМИ ФЕРМЕНТАМИ СОИ.
7.1. Взаимодействие протеаз сои с ингибиторами надоеадочной жидкости
7.2. Выделение белковых ингибиторов из надоеадочной жидкости
7.3. Гель-фильтрация препарата белковых ингибиторов
на сефадексе 6-75
7.4. Электрофорез в ПААГ препаратов белковых ингибиторов
7.5. Изоэлектрическое фокусирование препарата ингибиторов
7.6. Схема выделения препаратов ингибиторов
7.7. Аффинная хроматография протеаз сои на иммобилизо-. ванных белковых ингибиторах
8. ДЕЙСТВИЕ ПРОТЕАЗ СОИ НА СОБСТВЕННЫЕ БЕЛКИ
9. ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПРОТЕАЗ И ИХ ИНГИБИТОРОВ
ПРИ ПРОРАСТАНИИ СЕМЯН СОИ
10. ВЫВОДЫ
11. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ;

Для высушивания растворы помещали в чашки Петри, устанавливали их в вакуумной камере сублимационной установки "Стокс". Предварительное замораживание проводили при скорости 0,014 - 0,020 град/сек до -70°С. Температура сушки не превышала +30°С. Предварительные опыты показали, что такой режим сушки способствует наилучшему сохранению активности препаратов.
3.9. Гель-хроматография препаратов протеаз и ингибиторов.
Гель-хроматография - одна ,из форм распределительной хроматографии - широко используется для разделения компонентов по молекулярной массе /Детерман,1970/.
Мы использовали гель-фильтрацию на сефадексах Є -75 и о-100 для разделения фракций белковых ингибиторов и определения молекулярной массы протеаз.
Фракционирование проводили при +4°С, фракции собирали на коллекторе фракций фирмы 1-КВ /Швеция/. Регистрацию оптической плотности элюата осуществляли на автоматическом регистраторе "Увикорд" при длине волны 280 нм. Параметры используемых колонок и другие материалы по гель-хроматографии даны в соответствующих разделах диссертации.
3.10. Ионообменная хроматография.
Ионообменная хроматография является одним из наиболее эффективных современных приемов для разделения смеси белков, близких по физико-химическим свойствам /Гинодман,1964/.
Для очистки ферментов использовали ионообменную хроматографию на ОЕ-32-целлюлозе ”Ма£тап" /Англия/ и йЕАЕ -УоуореагС -650 /Япония/. Перед фракционированием ОЕ-32-целлюлозу готовили к работе следующим образом. Навеску ионообменника суспендировали в 15 объемах 0,5 н НСЕ, оставляли на 30 минут при комнатной температуре,