Природный ингибитор липазы гриба Rhizopus Microsporus

• Автор: Ахмедова, Захро Рахматовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Ташкент
• Количество страниц: 125 c. : ил

С ОДЕРЖАНИЕ Стр^
ГЛАВА I. ПРИРОДНЫЕ ИНГИШТОРЫ ФЕРМЕНТОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 6
1.1. Ингибиторы протеиназ из грибов
1.2. Ингибиторы нуклеаз грибов
1.3. Белковые ингибиторы ферментов липидного обмена
ГЛАВА 2. ОБЩИЕ ОБЩЕНИЯ О ЛИПОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТАХ
ГРИБОВ
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Культивирование гриба
3.2.- Препарат липазы из гомогената мицелия
3.3. Определение липазной активности
3.4. Определение ингибиторной активности
3.5. Определение белка
3 .6. Аналитический диск-электрофорез на ПААГе
3.7. Препаративный диск-электрофорез на ПААГе
3.8. Энзимограмма липаз на ПААГе
3.9. Обработка ингибиторным белком гелевых столбиков
с липазной активностью после электрофореза
3.10. Очистка ингибитора липазы
З.ТГ. Определение молекулярной массы
3.12. Определение аминокислотного состав ингибитора
3.13. Определение N -концевой аминокислоты ингибиторного белка
3.14. Определение С -концевой аминокислоты
3.15. Методика получения поликефамида

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОЩУЩЕНИЕ
ГЛАВА 4. ОШАРУКЕНИЕ ИНГИБИТОРА ЛИПАЗЫ В КУЛЬТУРЕ
RHIZOFUS MICROSPORUS
ГЛАВА 5. ВЬЩЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ИНГИШТОРА ЛИПАЗЫ ИЗ НАДОСАДОЧНОЙ ЖИДКОСТИ ГОМОГЕНАТА МИЦЕЛИЯ ГРИБА 62
5.1. Получение препарата ингибитора
5.2. Свойства ингибитора липазы
5.3. Определение молекулярной массы ингибитора 70
5.4. Определение и- и С-концевых аминокислот ингибитора
5.5; Субъедияичная структура ингибитора липазы 74
ГЛАВА 6. ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА РАЗЛИЧНЫХ ФОРМ ЛИПАЗ ИЗ ГРИБА RHIZOFUS MICROSPORUS И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ИНГИШТОРОМ
6.1. Получение частично очищенных комплексных препаратов внеклеточных липаз
6.2. Очистка внеклеточных и внутриклеточных липаз
гриба Rhizopus micro sporus
6.3; Изучение взаимодействия ингибитора с различными
формами липазы гриба Rhizopus microsporus
ВЫВ ОДЫ I0I-I02
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Исследование регуляции биосинтеза ферментов является одним из основных направлений современной биологии. Среди множественных факторов, регулирующих активность ферментов, особое место занимают ингибиторы белковой природы. По современным представлениям, белковые ингибиторы являются компонентами системы оперативного контроля активности ферментов в клетке;
Их действие осуществляется без потери фермента и ингибитора;
В настоящее время из микроорганизмов различных таксономических групп выделены и охарактеризованы специфические ингибиторы ряда ферментов: протеаз’, амилаз; ферментов нуклеинового обмена, хитинсинтетазы, АТФазы, фосфолипазы; лизоцима и т.д’. Для некоторых из них разработаны способы их иммобилизации, получены биоспецифические сорбенты на их основе. Они используются для изучения белок-белкового взаимодействия, сопровождающегося конформационными изменениями белков без нарушения их первичной структуры.
В то же время не для всех ферментов выделены их природные ингибиторы. Прежде всего это относится к липазам (К.Ф.-3,1*1.3). В связи с тем, что внутриклеточные липазы участвуют в метаболизме липидов, являющихся компонентами различных внутриклеточных структур, можно ожидать, что клетки контролируют активность этих ферментов и с помощью белковых ингибиторов; Поэтому поиск природных ингибиторов липаз среди внутриклеточных белков микроорганизмов является актуальным. В последние годы в институте микробиологии АН УзССР описаны ряд продуцентов липаз, среди которых - Rhizopus microsporus, отличается как высокой продуктивностью, так и содержанием мно-

теаз - фенилметилсульфонилфторид (фирмы "Зеш/а"). Подавление липазной активности в культуральной жидкости происходит также и с внесением ингибитора протеаз, что позволяет исключить подозрение на протеолитическую деградацию синтезированных липаз.' Отдельно било показано, что указанный реагент в пределах использованных концентраций не оказывает влияния на ли-пазнуго активность фильтрата культуральной жидкости (рис. 4.2).
Чтобы убедиться в справедливости второго предположения, далее мы изучали распределение липазной активности в фильтрате культуральной жидкости и в надосадочной жидкости гомогена-та мицелия 24-часовой культуры,- Результаты показали, что фермент преимущественно выделяется из клеток (табл.- 4;6);; Так как уровень липазной активности в фильтрате культуральной жидкости в 4-5 раз больше, чем в надосадочной жидкости гомогена-та мицелия;
Сравнительно низкое содержание внутриклеточных липаз могло быть обусловлено присутствием в мицелии гриба продуктов метаболизма, ингибирующих ферменты;' При осаждении белков надосадочной жидкости гомогената мицелия четырьмя объемами изопропанола суммарная липолитическая активность по сравнению с исходным раствором падает незначительно.’ Она также не изменялась в процессе диализа против фосфатного буфера pH 7,4, а также при обработке ацетоном и этанолом. Следовательно, низкомолекулярные метаболиты не влияли на активность липаз
Согласно литературным данным (иогиш., 1969, 1976). комплекс фермент-белковый ингибитор может быть разрушен под действием различных детергентов и денатурантов,таких как мочевина. С целью проверки возможного влияния мочевины на диссоциа-