Молекулярные механизмы биогенеза хлоропластов

• Автор: Алиев, Курбон
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Душанбе
• Количество страниц: 341 c. : ил

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ЭДТА - этшгендиаминтетрауксусная кислота
РДФ - рибулоз о-1,5-диф осфат
РДФ-каза - рибулоз о-1,5-дифосфаткарб оксилаза/оксигеназа
ЕС - большая субъединица 1ДФ-карбоксилазы
МС - малая субъединица ЩФ-карб оксилазы
ТЭА - триэтаноламин
Ш - трихлоруксусная кислота
АТФ — аденозинтрифосфорная кислота
ГГФ - гуанозинтрифосфорная кислота
дтт - дитиотреитол
Риф - рифампицин
ад - актиномицин Д
ХАФ - хлорамфеникол
ЦТ - циклогексимид
рРНК - рибосомальная рибонуклеиновая кислота
тРНК - транспортная рибонуклеиновая кислота
мРНК - информационная рибонуклеиновая кислота
МД - мегадалвтон
вД - килодальтон
ЭТЦ - электронно-транспортная цепь

ВВЩЕНИЕ
ГЛАВА I. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ВЗАИМОДЕЙСТВИИ ЯДЕРНЫХ И ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ ГЕНОВ В БИОГЕНЕЗЕ ХЛОРОПЛАСТОВ
Глава II. МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
П.1. Подготовка экспериментального материала
а). Инкубация проростков в среде с ингибиторами синтеза белка и мечеными аминокислотами
б). Инкубация проростков в среде с ингибиторами синтеза РНК и мечеными предшественниками
в). Включение меченых аминокислот в иммунопреципитат
П.2. Препаративные методы П.2.1. Выделение и очистка хлоропластов
П.2.2. Выделение и очистка фракции свободных
рибосом
П.2.3. Выделение и очистка мембраносЕязанных
рибосом
П.2.4. Выделение рибосом из цитоплазмы
П.2.5. Центрифугирование рибосом в линейном
градиенте концентрации сахарозы .... 42 П.2.6. Выделение субчастиц рибосом из хлоропластов
П.2.7. Получение препаратов полирибосом хлоропластов

П.2.8. Центрифугирование полирибосом в градиенте концентрации сахарозы
П.2.9. Выделение РНК и ее фракционирование
П.2.10. Выделение ЦЦФ-карбоксилазы из листьев
гороха
П. 2.II. Выделение ВДФ-карбоксилазы из листьеЕ
хлопчатника
П. 2.12. Выделение свободной и мембраносвязанной ЭДФ-карбоксилазы
П.З. Аналитические методы П.3.1. Центрифугирование рибосом в градиенте хлористого цезия
П.3.2. Центрифугирование полирибосом в градиенте
хлористого цезия
П.3.3. Определение скорости синтеза белков рибосом хлоропластов
П.3.4. Определение скорости синтеза белков субъединиц рибосом
П.3.5. Определение удельной радиоактивности
белка
П.3.6. Определение удельной радиоактивности

П.3.7. Фракционирование РНК электрофорезом на
ПААГ
П.3.8. Испытание матричной активности РНК е
бесклеточных системах синтеза белка
П.З.9: Измерение карбоксилазной и оксигеназной
активности ГДФ-карбоксилазы

гидом до конечной концентрации 4 % и центрифугировали в префор-мированном градиенте плотности Свої (1,19 г/см^-1,60 г/см^). Растворы Свої готовили на ТЭА-буфере, содержащем 4%-ный формальдегид. Центрифугирование проводили при 40000 об/мин в роторе С-45 центрифуги К-32 18 часов. Значение плавучей плотности определяли по уравнению Иффта и др. ( іт ег аі., 1961).
II.3.3. Определение синтеза белков рибосом хлоропластов В опытах использовали 14С-дейцин (удельная активность 20 мкКи/мл) и ^4С-лейцин (удельная активность 12 мкКи/мл). Выделение рибосом и рибосомных частиц осуществляли по вышеописанной методике. Предварительно обрабатывали рибосомы пуромицином (50 мкг/мл) для удаления насцентных белков. На градиент наслаивали 4 мг рибосом. Центрифугирование проводили в течение 5.часов при 24000 об/мин в роторе Бїї-зо центрифуги ВАК-601. Из каждой пробирки собирали по 30 фракций по I мл и разводили холодной водой, оптическую плотность градиента измеряли при 260 и 235 нм. Измерение проводили на спектрофотометре СФ-4а. После этого к фракциям рибосом добавляли в качестве носителя по 10 мкл раствора альбумина (2 мкг/мл) и фиксировали 5%-ной ТХУ. Затем наносили на миллипоровые фильтры ЕУФС, промывали 5%-ной ТХУ, этанолом и просчитывали радиоактивность рибосом.
II.3.4. Определение синтеза белков субъединиц рибосом Для определения скорости синтеза белков субъединиц рибосом производили их центрифугирование в сахарозном градиенте смеси субъединиц, образовавшихся при диссоциации рибосом в 0,5 М нн4С1, 0,001 М м8С12, 0,01 м трис-НС1, pH 7,6. Смесь субъединиц наслаивали на градиент сахарозы 10-30 %. Центрифуги-