Изучение взаимодействий белков с ДНК в интактных хлоропластах методом ковалентной фиксации

• Автор: Мельник, Светлана Михайловна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 139 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ

I. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
II. ВВЕДЕНИЕ
III. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. СТРУКТУРА ГЕНОМА ХЛОРОПЛАСТОВ
1.1. ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ГЕНОМА ХЛОРОПЛАСТОВ
1.2. МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НУКЛЕОИДОВ ХЛОРОПЛАСТОВ, СРАВНЕНИЕ ИХ С НУКЛЕОИДАМИ МИТОХОНДРИЙ И БАКТЕРИЙ
1.3. ДНК-СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ НУКЛЕОИДА ХЛОРОПЛАСТОВ
1.4. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОМА ХЛОРОПЛАСТОВ
2. КОМПЛЕКС 1,10-ФЕНАНТРОЛИН—Си(Н) КАК ХИМИЧЕСКАЯ НУКЛЕАЗА
2.1 ХИМИЧЕСКИЕ НУКЛЕАЗЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
2.1.1 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХИМИЧЕСКИХ НУКЛЕАЗ
2.1.2. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ МЕХАНИЗМА РАСЩЕПЛЕНИЯ ДНК
2.1.3. ХИМИЧЕСКИМИ НУКЛЕАЗАМИ
а) связывание с ДНК
б) роль кофакторов взаимодействия: ионов металлов, перекиси водорода
в) пути расщепления ДНК и продукты реакции
2.1.3. ПРИМЕНЕНИЕ ХИМИЧЕСКИХ НУКЛЕАЗ
2.2. НУКЛЕАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ КОМПЛЕКСА 1,10-фЕНАНТРОЛИН-Си(П)
2.2.1. ОТКРЫТИЕ НУКЛЕАЗНОЙ АКТИВНОСТИ
2.2.2. СВЯЗЫВАНИЕ КОМПЛЕКСА С ДНК
2.2.3. ВЛИЯНИЕ КОФАКТОРОВ: Си2+ И Н202 НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ РАСЩЕПЛЕНИЯ ДНК ФЕНАНТРОЛИНОМ
2.2.4. ПРОДУКТЫ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ ДНК, ИНДУЦИРОВАННОГО КОМПЛЕКСОМ
1,10-ФЕНАНТРОЛИН-Си(И)

3. МЕТОДЫ СШИВКИ БЕЛКОВ С НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ
3.1. ПРИМЕНЕНИЕ ДИМЕТИЛСУЛЬФАТА ДЛЯ ИНДУКЦИИ ДНК-БЕЛКОВОЙ
СШИВКИ
3.2. ДНК-БЕЛКОВЫЕ СШИВКИ, ИНДУЦИРОВАННЫЕ ОБЛУЧЕНИЕМ УЛЬТРАФИОЛЕТОМ
3.3. ДНК-БЕЛКОВЫЕ СШИВКИ, ИНДУЦИРОВАННЫЕ ПЕРЕКИСЬЮ ВОДОРОДА И ИОНАМИ ПЕРЕХОДНЫХ МЕТАЛЛОВ
IV. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. МАТЕРИАЛЫ
2. МЕТОДЫ
2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ЯДЕР ИЗ ЭРИТРОЦИТОВ КУРИЦЫ
2.2. ПОЛУЧЕНИЕ РАСТВОРИМОГО ХРОМАТИНА
2.3. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ХЛОРОПЛАСТОВ
2.4. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА КЛЕТОЧНЫХ ЯДЕР ИЗ
ПРОРОСТКОВ ГОРОХА
2.5. ИНДУКЦИЯ ДНК — БЕЛКОВОЙ СШИВКИ
2.6. ВОССТАНОВЛЕНИЕ ДНК-БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ
2.7. ГИДРОЛИЗ ДНК - БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ
2.8. УДАЛЕНИЕ НЕПРИШИТЫХ БЕЛКОВ ПЕРЕОСАЖДЕНИЕМ ДНК И ДНК-
БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ ЦЕТАВЛОНОМ
2.9. УДАЛЕНИЕ НЕПРИШИТОЙ ДНК
2.10. АНАЛИЗ ДНК-БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ В СИСТЕМЕ ДИАГОНАЛЬНОГО ДВУМЕРНОГО ПААТ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
2.11. ЭЛЕКТРОПЕРЕНОС ФРАГМЕНТОВ ДНК ИЗ ГЕЛЯ НА НЕЙЛОНОВУЮ МЕМБРАНУ
2.12. ГИБРИДИЗАЦИЯ ДНК, ФИКСИРОВАННОЙ НА НЕЙЛОНОВОЙ МЕМБРАНЕ С РАДИОАКТИВНО МЕЧЕННЫМИ ЗОНДАМИ
2.13. ПОЛУЧЕНИЕ РАДИОАКТИВНО МЕЧЕННЫХ ЗОНДОВ ДНК
2.14. УДАЛЕНИЕ БОЛЬШЕЙ ЧАСТИ КОВАЛЕНТНО СШИТОЙ С БЕЛКОМ ДНК
2.15. ВВЕДЕНИЕ РАДИОАКТИВНОЙ МЕТКИ В БЕЛОК ПО МЕСТУ СШИВКИ С ДНК
2.16. СИСТЕМА ПААГ Д ЛЯ РАЗДЕЛЕНИЯ ДНК - СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ, МЕЧЕННЫХ ПО МЕСТУ СШИВКИ С ДНК
2.17. ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ ДНК - БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСА in situ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКРОКОККОВОЙ НУКЛЕАЗЫ
2.18. ВЫДЕЛЕНИЕ ФРАГМЕНТОВ ДНК ПОСЛЕ НУКЛЕАЗНОГО ГИДРОЛИЗА И ИХ РАЗДЕЛЕНИЕ В АГАРОЗНОМ ГЕЛЕ
2.19. ВАКУУМНЫЙ ПЕРЕНОС ДНК ИЗ АГАРОЗНОГО ГЕЛЯ НА МЕМБРАНУ
2.20. ДВУМЕРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНП-КОМПЛЕКСОВ
2.21. ОКРАШИВАНИЕ ГЕЛЯ КУМАССИ R
2.22. ИССЛЕДОВАНИЕ УЛЬТРАСТРУКТУРЫ ДНК - БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСА ХЛОРОПЛАСТОВ И ХРОМАТИНА ЯДЕР

2.23. ЭКСТРАКЦИЯ СУММАРНЫХ БЕЛКОВ ХЛОРОПЛАСТОВ
2.24. ЭКСТРАКЦИЯ БЕЛКОВ ОСНОВНОГО ХАРАКТЕРА
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТЕЙ И МЕХАНИЗМА
МЕТОДА ДНК-БЕЛКОВОЙ СШИВКИ, ИНДУЦИРОВАННОЙ КОМПЛЕКСОМ 1,10-ФЕНАНТРОЛИН-Си(П)
1.1. ОБРАЗОВАНИЕ ДНК-БЕЛКОВОЙ СШИВКИ В УСЛОВИЯХ /А ЛЯТЛО
1.2. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА РЕАКЦИИ ОБРАЗОВАНИЯ
ДНК-БЕЛКОВОЙ СШИВКИ
1.3. ВЛИЯНИЕ КОМПОНЕНТОВ РАДИКАЛ -ПРОД УЦИРУЮЩЕЙ СИСТЕМЫ (ФЕНАНТРОЛИНА, ИОНОВ СШ, ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА) НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ОБРАЗОВАНИЯ ДНК-БЕЛКОВОЙ СШИВКИ
1.4. ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ РАДИКАЛ-ПРОДУЦИРУЮЩЕГО КОМПЛЕКСА ДЛЯ КОВАЛЕНТНОЙ ФИКСАЦИИ БЕЛКОВ НА ХЛОРОПЛАСТНОЙ ДНК В УСЛОВИЯХ Ш БГГи
2. ИЗУЧЕНИЕ ДНК-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ ХЛОРОПЛАСТОВ
2.1. ОБНАРУЖЕНИЕ БЕЛКОВ, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИХ С
ХЛОРОПЛАСТНОЙ ДНК
2.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УЧАСТКОВ ХЛОРОПЛАСТНОЙ ДНК, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИХ С ОБНАРУЖЕННЫМИ БЕЛКАМИ
2.3. ИССЛЕДОВАНИЕ МАКРОСТРУКТУРЫ НУКЛЕОИДА ХЛОРОПЛАСТОВ
2.4. ИССЛЕДОВАНИЕ БЕЛКОВОГО СОСТАВА ХЛОРОПЛАСТНЫХ ДНП-СТРУКТУР
VI. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
VII. ВЫВОДЫ
VIII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

компактную организацию нуклеоидов, Кроме того, они указывают на то, что белки 69 кДа и 14 кДа более прочно связаны с пластидной ДНК, чем белки 31 и 30 кДа. Сила связывания этих белков с пластидной ДНК, если сопоставить с ядерными гистонами и негистоновыми белками хромосом, такими как HMG, по —видимому, соответствует прочности связывания гистона Н1 или негистоновых белков эукариотического хроматина с ДНК. Интересно отметить, что среди ДНК—связывающих белков нуклеоидов не было обнаружено таких, которые связаны с хпДНК более прочно, чем ядерные гистоны, образующие коровуто частицу нуклеосомы (core particle), по крайней мере в тех фракциях, которые солюбилизируются обработкой NaCl (Nemoto et al„ 1990, 1991).
Вопрос о наличии нуклеосомной организации в нуклеоидах хлоропластов до сих пор остается спорным. Некоторым авторам удалось обнаружить нуклеосомо — подобные структуры (Kuroiwa et al„ 1981; Briat et al., 1982; Rose & Lindbeck, 1982; Kiseleva et al., 1989; Sakai et al,, 1991; Salganik et al., 1991; Nakano et al., 1993). Однако попытки их выделения и биохимического изучения не дали положительного результата (Briat et al., 1982).
1.4. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОМА ХЛОРОПЛАСТОВ
Процесс экспрессии генов включает ряд последовательных этапов: транскрипцию, процессинг РНК, трансляцию и сборку белковых комплексов. На каждом из этих этапов может осуществляться контроль экспрессии генов как со стороны хлоропластного, так и со стороны ядерного геномов.
Геном пластид слишком мал, чтобы содержать большое число регуляторных генов, поэтому решающая роль в регуляции экспрессии пластидного генома, а также в экспрессии ядерных генов, кодирующих белки пластид, принадлежит генетической информации, содержащейся в ядре. Тот факт, что многие ядерные мутации блокируют развитие хлоропластов, является аргументом в пользу регуляции развития хлоропластов ядерными генами (Sasaki et al., 1989).
Регуляторные механизмы, участвующие в экспрессии хлоропластных